文档介绍：蛋白样本制备与Western Blot
主要内容
蛋白样本制备的目的
1
蛋白样本制备总体原则和策略
2
案例分析—细胞总蛋白的提取
3
成功的 Western Blot
6
蛋白提取产品选择指南
4
蛋白定量方法的选择
5
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一蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础
蛋白样本
activity assays
protein microarrays
SDS-PAGE /IEF
immunoblotting
mass spectrometry
2-DE
EMSA
ELISA
蛋白样本制备的目的: 后续应用
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二蛋白样本制备的原则
蛋白
样本
制备
原则
方法应具备标准化,具有重现性、可靠性、简便性;
尽量抽提完全;
应使所有蛋白全部处于溶解状态
防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性
防止在抽提过程中发生化学修饰
如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白
必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
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二蛋白样本制备的策略
制备蛋白的目的
活性分析
免疫印迹杂交
免疫沉淀或共沉淀
1D 2D
EMSA CHIP等
实验材料
细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等
目的蛋白的结性质与分布
分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……
方法的选择
1 自行配制抽提试剂,
根据文献方法或经验提取
2 购买商品化试剂盒,
按其说明书的方法提取
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三案例分析-- 细胞中总蛋白的制备
高速离心收集上清即得全蛋白样本
细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟
蛋白定量和SDS-PAGE检测
裂解样品
离心收集
定量检测
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
表面活性剂
缓冲液
蛋白酶抑制剂
磷酸酶抑制剂
其它:H2O、NaCl、等
还原剂
RIPA Buffer
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
缓冲液
Tris-HCl(),提供pH环境,使蛋白保持稳定,增加溶解性。
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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
表面活
性剂
溶解膜与脂膜,溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白)
分为离子型(如SDS、脱氧胆酸盐等)和非离子型(如NP-40、Triton-100、tween系列等)。
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各类表面活性剂特点
1 阴离子型:
SDS 脱氧胆酸盐
2 阳离子型:
CPB和CTAB
3 双性离子型:
CHAPS
Zwittergent系列
4 非离子型:
Brij系列
Triton-100
Nonidet P40
Tween 系列等
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