文档介绍：binantDNATechnology刘新文北京大学医学部生物化学与分子生物学系第一节概述DNA克隆(DNAcloning):应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆(genecloning)。基因工程(icengineering):实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术(binantDNAtechnology)一、克隆体系:目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等1、目的基因(targetgene):cDNA或基因组DNA2、载体(vector):质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、plementaryDNA):指体外经反转录合成的,与RNA(常指mRNA)互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA(genomicDNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,称为基因组DNA。质粒(plasmid):存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。(restrictionendonuclease):存在于细菌体内,能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。3、工具酶:限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶,patibleend)::大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、Klenow片段(Klenow酶)、:可用于粘端与平端的连接4、宿主细胞:大肠杆菌、酵母、动物细胞第二节DNA克隆的基本过程分、切、接、转、筛、表达一、“分”:目的基因及载体的制备1、分离基因的方法:化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR):在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶(常用Taq酶),经多次变性、退火、延伸循环反应,使目的DNA呈指数合成的过程cDNA文库(cDNAlibrary):以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary):利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有基因组DNA信息,总称基因组DNA文库2、常用载体:质粒、噬菌体、病毒DNA克隆载体(cloningvector):用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等表达载体(expressionvector):用于在宿主细胞中表达外源目的基因,获得大量表达产物二、“切”:限制性内切酶切割目的基因和载体DNA三、“接”:重组体的构建四、“转”:重组DNA分子导入受体细胞1、转化(transformation):将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌),并使其获得新的表型的过程2、转染(transfection):将外源DNA导入真核细胞的过程3、感染(transfection):以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的细胞,并在细胞内扩增。也称为转导(transduction)五、“筛”:筛选出含重组DNA的受体细胞1、直接选择法:遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂交)】2、非直接选择法:免疫化学法、酶联免疫检测法六、“表达”:使克隆基因在宿主细胞中复制、表达1、外源基因在原核细胞的表达大肠杆菌是最常用的原核表达体系真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体2、真核表达体系:酵母、昆虫及哺乳动物细胞等