免疫荧光技术.ppt

文档介绍：第十三次实验一、免疫荧光技术二、实验考试复****br/>免疫荧光技术—直接法检测B淋巴细胞
原理:B淋巴细胞表面携带的mIg,为B细胞特异性的表面标志,能与相应的特异性抗体结合。用荧光素标记的抗Ig血清进行免疫荧光染色后镜检,能与荧光素标记抗体结合的细胞,在荧光显微镜下细胞膜可呈现荧光,即为SmIg阳性细胞,也就是B淋巴细胞。同时用普通光源照明,计数该视野的淋巴细胞总数,根据发荧光和不发荧光细胞的计数,可算出SmIg细胞占淋巴细胞的百分比。
方法一
1、将分离得到的外周血单个核细胞(PBMC)用毛细吸管吸取,轻轻将细胞滴吹铺于玻片上,涂片范围为1cm2左右。
2、以冷风吹干,用冷***固定5~15min,冷风吹干。
3、滴加荧光抗体(抗人IgM-FITC)1滴,置温盒放37℃保温30~60min。
4、取出细胞片, PBS洗涤3次,冷风吹干后置荧光显微镜下观察。
方法二
1、淋巴细胞悬液的制备,用含5%新鲜小牛血清的Hanks液制成每毫升内含1X107/ml淋巴细胞悬液。活的淋巴细胞应高于95%。
2、于离心管内加入淋巴细胞悬液100ul及1:10稀释的荧光色素(FITC)标记的兔抗人IgM抗体100ul,轻轻混匀摇动。
3、管口加塞。将离心管放入冰箱内作用40~60min。
4、于管内加入2ml的含小牛血清的Hanks液。轻摇混匀。离心1500rpm,5min。
5、(此步略)弃上清,再加入2ml含小牛血清的Hanks液,将细胞重复洗涤离心、沉淀一次。
6、倾弃上清液。余2mm高度,微量加样器混匀并取10~20ul涂片(铺开)大约1cm,自然风干或冷风吹干。置荧光显微镜下40倍观察。
7、在荧光显微镜下,先用普通光源计数视野中的淋巴细胞总数。每份标本至少计数200个淋巴细胞,然后用荧光光源计数阳性细胞百分率。
结果
先用紫外光计数荧光阳性细胞数,继用普通光源计数同一视野中淋巴细胞总数。
免疫荧光染色细胞的形态和类型:凡细胞呈现较强荧光,有明显的细胞轮廓,并可见环状或两个以上斑点或在细胞的一侧见有帽状结构的为mIg阳性细胞—B细胞。
计数200个淋巴细胞,着荧光者为B淋巴细胞,计算其百分率。正常值:±%
荧光显微镜
利用一定波长的激发光对样品进行激发,产生一定波长的荧光,对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。