文档介绍：内容
1、核酸提取与鉴定
2、印迹杂交技术
3、聚合酶链反应
4、重组DNA技术
5、转基因技术与基因打靶
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核酸提取与鉴定
研究对象:基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等
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第一节核酸提取
总原则:
保证核酸一级结构的完整性
避免杂质污染
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核酸提取的主要步骤:
破碎细胞
提取
纯化
——内容物释放
、纯化
,并去除杂质
 
核酸提取过程
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一、质粒DNA
质粒(Plasmid)是游离于细菌(及个别真核细胞)染色体DNA之外、能自主复制的遗传物质
多数是一种闭环DNA,大小为1-300kb,能够转化细菌,是基因载体
提取质粒DNA包括三个基本步骤
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1·培养细菌和扩增质粒
在培养基中加入抑制剂(例如***霉素)可以抑制细菌的蛋白质合成,从而抑制细胞分裂,而质粒DNA会继续复制,拷贝数可达3000个,这一过程称为质粒扩增
如果要扩增的质粒DNA携带***霉素抗性基因(CmR),可以用壮观霉素替代***霉素
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2·收获和裂解细菌
①机械法:超声波、玻璃珠等(易引起DNA断裂)
②化学试剂法:十二烷基硫酸钠(SDS)等(单用难以充分裂解)
③溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消化,再用化学试剂处理(最常用)
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3·分离纯化质粒
关键:除去染色体DNA
质粒DNA特性:
①相对较小(%-2%)
②闭环(染色体DNA大量断裂并且呈线性结构)
提取方法:***化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法等
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(1)***化铯密度梯度分离法
EB分子可嵌入相邻碱基对之间,使DNA解旋
开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋,可结合大量EB,DNA-EB复合物含EB越多,密度越小
闭环质粒DNA没有游离末端,不易解旋,结合少量EB,密度较大
在饱和EB条件下,质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大,经***化铯密度梯度离心,可分离提取质粒DNA
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