文档介绍：实时荧光PCR技术原理
李庆阁
厦门大学分子诊断实验室
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1、PCR技术
PCR (Polymerase Chain Reaction)
—聚合酶链式反应
1985年K. Mullis发明PCR技术,并因此获得诺贝尔化学奖。
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PCR 原理三步曲第一步:加热变性
靶序列
靶序列
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PCR 原理三步曲第二步:退火,引物特异地与靶序列结合
靶序列
引物 2
引物1
靶序列
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
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PCR 原理三步曲第三步:延伸,DNA聚合酶在引物引导下,按照靶序列复制
靶序列
DNA 聚合酶
引物
5’
5’
3’
3’
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PCR 原理靶序列的大量扩增
循环数. 扩增子数(拷贝数)
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824(10亿)
高灵敏度!
7 循环= 128 扩增子
6 循环= 64 扩增子
5 循环= 32 扩增子
4 循环= 16 扩增子
3 循环= 8 扩增子
2 循环= 4 扩增子
1 循环= 2 扩增子
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PCR技术——基本特点
灵敏度高

(HBV为例) 抗原、抗体核酸杂交 PCR法
检测灵敏度 ng/ml pg/ml fg/ml
特异性强
快速简便 
对样品要求低样品来源非常广泛
不需分离靶序列
极微量模板
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PCR技术——局限性
假阳性:
样本间交叉污染、
PCR扩增产物污染
非特异性扩增产物。
解决方案:
防污染
杂交探针
高度重视!
遗留污染
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样
品
处
理
PCR
扩
增
产
物
分
析
PCR技术—扩增产物分析
实时 PCR
重吧榜食躇眠细伞武头荣抄撒辩乾楞列唱件窿涎娄盆墨膝藐侩嘎聂歇绪塞荧光定量PCR荧光定量PCR
发展方向
从定性到定量
克服假阴性和假阳性
高通量扩增与实时分析系统
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