文档介绍：第八节常用定量分析方法
三、薄层扫描法
薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法,又称薄层色谱扫描法(TLCS),相应仪器称为薄层扫描仪(Thin Layer Chromatogram Scanner)。
薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点,或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。
(一)基本原理
薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描,薄层色谱扫描是指固定波长,斑点移动,测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。
1、薄层吸收扫描法
基本原理:Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象,斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度,说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响,获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线,即Kubelka-Munk曲线。
光源:钨灯和氘灯;
灵敏度:在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定,其灵敏度可达ng级;
适用范围:适用于在可见、紫外区有吸收的物质,及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。
2、薄层荧光扫描法
基本原理:F=’I。ECL或F=KC
光源:氙灯或汞灯。
灵敏度:最低可测到10-50pg。
适用范围:适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。
Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描,无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时,用斑点荧光强度的积分值(色谱峰峰面积)与斑点中组分的含量代替上式中F与C 进行运算。
(二)薄层色谱的规范化操作
1、仪器与材料
①薄层板;②涂布器;③点样器材;④展开箱(层析缸)⑤显色与检测仪器
2、操作方法
①薄层板的制备;②点样;③展开;④检测;
(三)定量分析方法
1、方法学考察
新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察,以说明新建方法的可靠性,考察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。
(1)工作曲线
①检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校直为直线,否则,调整SX值再校正,直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。
②考察工作曲线是否过原点,以便确定采用一点法或二点法定量。
③确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直,也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线,因此需确定点样量的上、下限。
为降低定量误差,最好调整点样量,使供试品与对照品的峰面积相接近。
为了克服薄层板间差异,外标法及内标法均应采用随行标准法,即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。
(2)精密度考察
取同一供试品溶液,在同一块薄层板上以相同点样量平行点5点以上,展开后测定其峰面积,求算相对标准差(RSD),作为衡量定量分析结果精密度的指标。RSD应小于4%。
式中:为n次测量的平均值,S为标准差。
(3)准确度考察
回收率是衡量定量方法准确度的指标,常用加样回收率(R)来衡量,其值应在95-105%之间,测量数据一般为5-6个。
将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上,展开后进行薄层扫描,测定各斑点的峰面积,计算各溶液中组分的量,计算回收率(R)。
(4)统计检验
统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度(偶然误差或系统误差)间是否存在显著性差异,说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。
统计检验包括F检验与t检验。
F检验即精密度差别检验,用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异,一般为单侧检验。
t检验即准确度差别检验,用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时,则新方法可以代替旧方法,t检验一般为双侧检验。
t检验与F检验的具体方法参见分析化学的有关论著,此从略。