文档介绍：底物浓度对酶促反应速度的影响
——米氏常数的测定
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目的要求
(1)了解底物浓度对酶促反应的影响
(2)掌握测定米氏常数Km的原理和方法
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实验原理
Km定义:
Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时
所对应的底物浓度。
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Km的意义
Km是酶的特征常数之一,不同的酶Km值不同,同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小: Km
值大,表明亲和力小;Km值小,表明亲和力大。
测定Km值是酶学研究的一个重要方法。
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酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示
V[S]
v = Km + [S ]
v : 反应初速度(微摩尔浓度变化/min)
V : 最大反应速度(微摩尔浓度变化/min)
[S]:底物浓度(mol/L)
Km: 米氏常数(mol/L)
此方程表明,当已知Km及V时,酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
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双倒数作图法测定Km值:
1 Km 1 1
v V [S] V
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胰蛋白酶的性质
胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解,产生自由氨基端。
用甲醛滴定法测定氨基酸,甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合,形成羟甲基衍生物,使N+H3上的H+游离出来,这样就可以用碱滴定N+H3放出H+ ,测出氨基酸。
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氨基的测定
甲醛滴定法
CH2
NH2
HCHO
COO-
CH2
NHCH2OH
HCHO
COO-
CH2
NH(CH2OH)2
COO-
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试剂和器材
1. 10~40g/L酪蛋白溶液():
四种不同[S]的酪蛋白标准溶液。
2. 中性甲醛溶液(自己配制)
%酚酞乙醇溶液
NaOH溶液。
5. 胰蛋白酶溶液(已配好)
试剂
器材:
碱式滴定管
37度水浴
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1. 配制中性甲醛
量取75mL分析纯甲醛加15mL %酚酞乙醇溶液, NaOH滴至微红,密闭。
,加入5mL甲醛与1滴酚酞,,4个瓶颜色应当一致,编号。
操作方法
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