文档介绍：(Comprehensive Experimental Skills Training Ⅱ)
课程代码: 18112080 学分:3 总学时数:54
先修课程: 细胞工程开课对象:2011级生物技术专业学生
一、目的要求
通过课程学习,使学生逐步掌握细胞工程技术实验的基本方法、基本技术、实验设计原则以便获取细胞工程技术知识;提高对实验中各种实验现象的观察、分析、思考和解决问题的能力;培养科学的思维方法、实事求是的科学态度和严谨的学风;提高分析、归纳问题和文字表达能力。
二、实验内容
实验一器材的清洗与消毒
:基础
:
(1)熟悉和掌握细胞培养中所用到的器皿和器械的清洗和消毒技术;
(2)掌握针对具体目的和器具有不同的清洗和消毒策略。
:
对细胞培养中所用到的器皿和器械进行清洗和消毒。
(1)玻璃器皿
浸泡初次使用和培养后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿,常带有许多干涸在上面的灰尘,同时又由于生产的原因,常呈碱性并带有一些对细胞有毒性的物质,如铅和砷等。在使用前要经稀盐酸(5%)浸泡,中和其中的碱性物质便于清洗。用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着,干涸后不易刷洗掉,故用后要立即用清水浸泡。
刷洗浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗去玻璃器皿上的杂质。刷洗次数太多,会损害器皿的表面光洁度,洗涤剂有使pH上升的趋势,所以宜选用软毛刷和优质的洗涤剂。禁用去污粉,因其含有沙粒,会严重破坏玻璃器皿的光洁。
酸洗刷洗不掉的极微量杂质经过洗液的强氧化作用可被除掉。洗液对玻璃器皿无腐蚀作用,去污十分有效,是清洗过程中最关键的一环。洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成,浸泡时,器皿要充满洗液。常用的洗液配方见附表一。
冲洗刷洗和洗液浸泡后都必须用水充分冲洗,不留任何残迹,然后用蒸馏水漂洗2~3次,凉干备用。
(2) 塑料器皿
塑料器皿耐腐蚀能力强,但质地较软,且不耐热,因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是:先用清水充分浸泡和冲洗;再用
2%NaOH溶液浸泡过夜,自来水冲洗,然后用5%稀盐酸浸泡30分钟,再用自来水冲洗,最后用蒸馏水漂洗3次,晾干备用。
(3) 滤器
玻璃滤器与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是酸浸,都可用抽滤法。
使用后,立即将清水注入滤器,抽气过滤,反复抽滤5次。
干净铬硫酸洗液或热浓硫酸注入滤器,抽气过滤至酸液滤过完毕。
用清水再次抽滤10次。
蒸馏水抽气过滤3次。
蔡氏滤器使用后弃去石棉滤膜,金属部分刷洗干净,最后用蒸馏水漂洗2~3次,晾干备用。
(4)橡胶塞
新购置的胶塞带有大量滑石粉,先用自来水冲洗干净,常规处理,每次用后的胶塞用水浸泡,然后用2%NaOH煮沸15min左右,自来水冲洗,再用1%稀盐酸浸泡30min,最后用自来水冲洗和蒸馏水漂洗,晾干后备用。
:操作
:
超净工作台,干燥箱,镊子,剪刀,解剖刀,酒精灯,75%酒精, 三角瓶,无菌培养皿等。
实验二培养基母液的制备和培养基的配置
:专业基础
:
学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前,为了使用方便和用量准确,常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时,只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
:
(1)大量元素母液的配制
各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍,,用蒸馏水分别溶解,按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中,即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶,贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时,每配1L培养基取此液100ml。
表1 MS培养基大量元素母液制备
序号
药品名称
培养基浓度(mg/L)
扩大10称量(mg)
 
1
NH4NO3
1650
16500
 
蒸馏水定容至1000ml
2
KNO3
1900
19000
3
CaCl2·2H2O 
440
4400
4
MgSO4·7H2O
370
3700
5
KH2PO4
170
1700
注意:
A 配制大量元素母液时,某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应,产生沉淀物。为避免此现象发生,母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用等级较高的分析纯,各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合,混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合,速度宜慢,边搅拌边混合。
B CaCl2·2H2O要在最后单独加