文档介绍：实验考马斯亮蓝R250显示洋葱内表皮
细胞微丝
真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构称
为细胞骨架(cytoskeleton),
●细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维
网架体系
有狭义和广义两种概念
◆在细胞质基质中包括微丝、微管和中间纤
维。
◆在细胞核中存在核骨架-核纤层体系。核骨
架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接,
贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。
微丝(microfilament, MF)
又称肌动蛋白纤维(actin filament), 是指真
核细胞中由肌动蛋白(actin)组成、直径为
7nm的骨架纤维。又名肌动蛋白丝,其长度不
定,多分布在近细胞膜的下方。微丝是肌动蛋
白亚单位组成的螺旋状纤维(F-actin),在不
同种类的细胞中,它们又与某些结合蛋白一起
形成不同的亚细胞结构,如张力纤维(stress
fiber)、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。
观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细
胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250
(coomassie brilliant blue R250)显示微
丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细
胞中普遍存在,与细胞对基质的附着、维持
细胞扁平铺展的形状有关;
实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝R250染动植物细胞胞质微
丝的方法。
2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。
实验原理
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料,它可以使
各种细胞骨架蛋白质着色,并非特异地显示微丝,细胞
内有些细胞骨架纤维在本实验条件下不够稳定,例如微
管;还有些类型的纤维太细,在光学显微镜下无法分
辨,因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维,直径
约40nm左右。张力纤维形态长而直,常常能贯穿细胞
全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学
等手段,本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微
丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液,其中咪唑是缓冲
剂,EGTA和EDTA螯合Ca 2+ 离子,溶液
中并提供Mg 2+ 离子,在此低钙条件下,
骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
实验用品
一、材料洋葱内表皮
二、试剂
1. mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法
Na2HPO4/KH2PO4缓冲液
() 50 ml
NaCl mol/L
重蒸馏水至 1000 ml
其中PB的配法:
mo1/L Na2HPO4 77 ml
mo1/L NaH2PO4 23 ml
2. M-缓冲液
咪唑(imidazole, ) 50 mmol/L
KC1 50 mmol/L
MgCl2 mmol/L
EGTA l mmol/L
EDTA mmol/L
巯基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L
甘油 4 mmol/L
用1 mol/L 。
3. 1%的Triton X-l00/M-缓冲液
4. %考马斯亮蓝R250染液,溶剂是:
甲醇 ml
冰醋酸 7 ml
蒸馏水 ml
5. 3%戊二醛(或3%甲醛)溶液,