文档介绍：脊髓缺血再灌住损伤
博士学位论文
摘要
文研究了脊髓缺血-再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion I/R )时微血
管内皮细胞粘附分子ICAM-1及其调节因子IL-1β的表达对血脊髓屏障损害的分子机理,主要结果为:
脊髓缺血-再灌注损伤模型建立:通过阻断大鼠腹主动脉造成脊髓腰尾段缺血。按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉。应用激光多谱勒血流仪,分别连续测定腰髓血流变化。取缺血前、缺血30分钟、缺血60分钟,缺血30分钟再灌2h、4h、6h、9h、12h 局部脊髓组织进行组织病理和透射电镜检查。结果:在缺血30分钟时腰髓局部血灌流量迅速下降至基线值的-%(P值=-17) 。再灌流时,局部血流迅速增高并超过基线水平。再灌流10分钟,%(P值=),随后逐渐降低,再灌流30分钟后,局部血灌流基本恢复基线水平(% P值=),以后血流量低于基线水平,出现缺血后延迟低灌流。直至再灌流4小时(-%,P值=)低灌流保持相对稳定,血流未见恢复。证实了缺血再灌流进行性延迟性低灌流( delayed hypoper fusion)存在。说明缺血缺氧本身对脊髓有损伤,而再灌后,在恢复血供条件下,其病理改变加重,揭示了脊髓存在再灌注损伤。
脊髓微血管内皮细胞与星型胶质细胞紧密连接构成血脊髓屏障,脊髓I/R损伤过程中血管内皮细胞是最先波及的部位,因此本实验总结为缺血低灌流是严重脊髓损伤后主要血流变化。而延迟性低灌流现象主要与血脊髓屏障损害相关。本实验结论:再灌注期脊髓损伤较缺血期明显,表明再灌流后脊髓发生了二次损伤。脊髓微循环障碍在脊髓I/R损伤中起重要作用。血脊髓屏障损害是脊髓I/R 过程中重要病理基础。
为深入探讨脊髓I/R损伤时血脊髓屏障的基本结构微血管内皮细胞表面粘附分子(Intercellular Adhesion Molecule-1简称ICAM-1)的变化作用,以及内源性细胞因子对其表达的调节。本实验以暂时性脊髓缺血为活体模型,对微血管内皮细胞表面
ICAM-1、白介素1-β(Interleukin-1B IL-1β)的基因及蛋白/多肽水平的表达,以及它们与多核型白细胞(PMN)在脊髓缺血区中浸润间的关系进行了研究。重点观察了微血管内皮细胞损伤后粘附蛋白ICAM-1表达的变化。
提取各实验组缺血再灌注损伤脊髓组织总RNA,经反转录合成cDNA,在特异性IL-1β、ICAM-1和3- 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物存在下,以GAPDH为内对照进行多聚酶链反应(PCR),应用地高辛标记cDNA探针技术检测脊髓I/R损伤后脊髓血管内皮ICAME-1mRNA和IL/1βmRNA表达。免疫组化及免疫荧光激光其聚焦显微镜(confocal)定性、定量测定脊髓微血管内皮细胞表面ICAM-1的表达,MTT生物检测法定量测定脊髓组织中IL-1活性。脊髓组织过氧化酶(MPO)活性测定用于定量反映浸润到脊髓组织中的PMN数量。动物实验表明,正常脊髓微血管内皮细胞表面仅有微量的ICAM-1表达,脊髓组织中有基础量的IL-1分泌,组织中未见PMN浸润,单纯缺血不引起细胞因子和粘附分子表达量的升高,再灌注后,缺血区细胞因子,粘附分子的表达及PMN的浸润先后发生了改变。再灌注2h,IL-1βmRNA的表达首先升高,约为对照组的2倍。其多肽活性(OD值/g) 随不同灌流时间出现时相变化,再灌注3h明显升高, 6h达到高峰, 并持续到12h。再灌注4h,ICAM-1 mRNA表达量明显升高,再灌注12h 其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了二分之一,再灌注9-12h,脊髓组织中MPO活性约为单纯缺血组的两倍。
以上结果提示:①脊髓I/R 损伤诱导了内源性细胞因子IL-1β及微血管内皮细胞表面粘附分子ICAM-1mRNA的表达,并伴有相应活性多肽及蛋白的合成分泌。②早期炎性因子IL-1β在基因和多肽水平的表达与ICAM-1相平行,说明损伤区细胞因子和粘附分子共同参与了对损伤组织的炎症应答,并在功能上有联系。而IL-1β早于ICAM-1的表达则提示,I/R损伤后内源性细胞因子IL-1β的分泌可能是调节内皮细胞表达粘附分子的因素之一。③再灌注损伤有PMN的大量聚集,而ICAM-1的调节表达与促进循环中的PMN与血管壁的粘附、游出血管浸润到周围脊髓组织密切相关。 I/R损伤后脊髓微血管内皮ICAM-1及其调节因子IL -1β的表达增加是导致血脊髓屏障损害的重要分子基础。④IL-1β对I/R
损伤后血管内皮ICAM-1表达具有调控作用。⑤脊髓I/R损伤微血管内皮细胞ICAM-1 的表达为时间性依赖