文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
Cyr61在机械通气性肺损伤中作用机制的研究
姓名:张燕
申请学位级别:博士
专业:麻醉学
指导教师:姚尚龙
2011-05
华中科技大学博士学位论文
中文摘要
第一部分:机械牵张对细胞活性和炎性因子 IL-8 表达的影响
目的本研究以 A549 细胞为研究对象,应用细胞力学方法研究 A549 细胞在周期
性机械牵张力的作用下细胞凋亡以及细胞因子分泌的情况,为 VILI 发生机制提供新
的理论依据。方法选取周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株 A549 细胞,用细胞拉伸加载
装置模拟机械通气,根据实验设计要求,给予加载应力为 15%,加载频率 ,加
载时间分别为 0min、15min、30min、60min、120min,观察不同时间点的细胞凋亡情
况。另外,给予加载应力为 15%,加载频率 ,加载时间分别为 0min、15min、30min、
60min、120min,用 ELISA 和定量 PCR 研究不同牵张时间下炎性介质 IL-8 的蛋白和 mRNA
的表达情况。结果给予加载应力为 15%,加载频率时,肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋
亡随着时间的延长增加,IL-8 的蛋白和 mRNA 的表达随着牵张时间的延长,表达增高
结论机械牵张 A549 细胞能引起细胞凋亡和导致下游炎性因子 IL-8 的分泌,本项实
验从细胞力学水平上为机械通气性肺损伤提供了理论依据。
关键词:肺泡Ⅱ型上皮细胞;机械牵张; 凋亡; IL-8
第二部分:Cyr61 基因 SiRNA 表达载体的构建
目的 Cyr61 是张力敏感基因,我们应用 SiRNA 介导的 RNA 干扰技术抑制机械牵张
导致的 Cyr61 表达上调,观察肺损伤的程度。方法根据 GenBank 数据库提供的 Cyr61
基因核苷酸序列,选择设计 3 条能转录 SiRNA 的 DNA 序列,命名 Cyr61-1 SiRNA、Cyr61-2
SiRNA、Cyr61-3 SiRNA,同时设计 1 条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各
自的寡核苷酸链,退火后连接入载体,转化扩增后进行序列测定。4 种
重组表达载体转染肺癌 A549 细胞,逆转录 RT-PCR 和 Western 印迹法分别从 mRNA 和
蛋白水平检测 Cyr61 的表达。结果经酶切鉴定和测序证实 Cyr61 靶向 SiRNA 重组表
达载体构建成功,它对大肠癌细胞 Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为 %和
%。结论 Cyr61 靶向 SiRNA 重组表达载体构建成功并能显著抑制 Cyr61 基因的
9
华中科技大学博士学位论文
表达,这为进一步探索 Cyr61 基因功能提供了理论依据。
关键词:Cyr61;RNA 干扰;SiRNA
第三部分:干扰 Cyr61 表达对 A549 细胞活性的影响
目的本实验拟研究周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株 A549 细胞对 Cyr61 表达的影
响,及干扰 Cyr61 基因表达对机械牵张引起 A549 细胞活性改变的影响。方法①对肺
泡Ⅱ型上皮细胞株 A549 细胞施加周期性机械牵张应力,加载频率 ,加载时间 2
h,加载应力分别为 5%、15%、30%。加载应力为 15%,加载频率 ,加载时间
分别 0min,15min,30min,60min,120min。用 PCR 法测定 Cyr61mRNA 的表达,用 western
法测定 Cyr61 蛋白含量。②设立阴性转染牵张组(牵张前48h 转染特异性空白质粒)、
阳性转染牵张组(牵张前 48h 转染特异性 cyr61 SiRNA)、空白对照组。然后给予加
载应力,加载幅度 15%,加载频率 ,加载时间为 2h,用流式细胞仪检测 A549
细胞的凋亡情况。结果随着加载应力的增加和加载时间的延长,Cyr61 蛋白含量和
mRNA 表达均增加;另外施加不同加载幅度后,Cyr61 蛋白含量和 mRNA 表达均增加。
结论肺泡Ⅱ型上皮细胞 Cyr61 的产生和释放与周期性的机械牵张应力呈强度和时间
依赖性。牵张引起 Cyr61 基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加,这可能参与
了 VILI 的发病机制。
关键词:RNA干扰;Cyr61;牵张;凋亡
第四部分:Cyr61 在机械牵张作用下肺泡Ⅱ型
上皮细胞转导机制中的研究
目的本研究以肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞为研究对象,观察Cyr61在牵张肺泡
Ⅱ型上皮细胞过程中对NF-κB活性及其下游炎性因子表达