文档介绍：酶联免疫吸吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA )的基本原理
方法类型及反应原理、、、试剂剂制制备、试剂剂制制备和和和和和和临床意义
酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一,是以酶标记抗体或抗原为主要试剂剂的一种标记免
疫分析技术。随着相关新技术的不断问世,如杂交瘤单克隆抗体技术(使各种对抗原决定簇高度
特异的单克隆抗体可以在体外批量生产)、生物素-亲和和素放大系统的应用以及与化化学发光和和电
化化学发光技术的偶联等,明显地提高民分析和和测定方法的特异性、灵敏度及其自动动化化程度,使酶
免疫技术不断更新,应用范围不断拓宽。当前前,酶免疫技术已与形式各异、各具特点和和用途的定
位、定量和和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展,在医学和和生物学中的应用日益广泛,是取
代放射免疫技术的主要方法之一。
酶免疫技术的特点
酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂剂,通过复合物中的酶催化化底物呈呈色而对被
测物进行定性或定量的标记免疫技术。
基本原理是:将酶与试剂剂抗原或抗体用交联剂剂结合起来,此种酶标记抗原或抗体与标本中相应
抗体或抗原发生特异反应,并牢固结合,在加加入相应的酶的底物时,底物被酶催化化生成呈呈色产物,
在免疫组化化染色时可指示待测反应物的存在和和定位,在酶免疫测定中,则可根据呈呈色物的有无和和
呈呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和和酶的高效催化化作用的基础上,
故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点,而且,可与其他技术偶联而衍生出
适用范围更广的新方法。
①使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某重酶连接成酶标抗原或抗体,且既保留其免疫活性又保留酶的活性。
③标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应,
并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。
酶免疫技术的分类:::
一一一、一、、、按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类:::
1. 酶免疫组织化化学技术(enzyme immunohisto chemistry,EIH ): 用于检测组织切片或细胞涂片中
的抗原或抗体。
2. 酶免疫测定技术(enzyme immunoassay,EIA): 用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体。
二二二、二、、、根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和和游离的酶标记物,,,可分为,可分为:::
1. 均相法(homogenous ):不需要分离结合和和游离的酶标记物,直接进行测定。
2. 异相法(heterogenous) :需要分离结合和和游离的酶标记物后才能进行测定。
酶免疫组
化化
酶免疫技
术均相酶免疫测定
酶免疫测
固相酶免疫测定
定
异相酶免疫测定
液相酶免疫测定
必备试剂剂:::
①固相抗原或抗体------ 免疫吸吸附剂剂
②酶标记的抗原或抗体------ 酶结合物
③酶反应的底物------ 底物
酶联试剂剂阳性对照酶标记物显色液 A 终止液
反应板显色液 B 浓缩洗涤液加加样枪与吸吸头阴性对照
双抗体夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的 ELISA ,适用于检测分子中具有
至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测。
工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和和酶标抗体分别与样品品中被检测抗原分子上两个抗
原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和和酶标抗体
的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范
围内)。测定复合物中的酶作用于加加入的底物后生成的有色物质量(OD 值),即可确定待测抗原含
量。若固相载体上的抗体和和酶标抗体分别与样品品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结
合,则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和和酶标抗原分别与样品品中被检测抗体分子结
合,则是双抗原夹心法。
【操作步骤】
双抗原夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗体的 ELISA 。
工作原理是:利用连接于固相载体上的抗原和和酶标抗原分别与样品品中被检测抗体分子上两个抗
原结合位点结合,形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和和酶标抗
原的量相对于待测抗体是过量的,因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测
范围内)