泛素结合酶UFC1 基因的原核表达载体构建.doc

文档介绍：泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体构建
周后兵,黄文雄,颜斌,阳晨希,刘姝梅,吴娟,贺爱兰*【基金项目】湖南省自然科学基金(09JJ6048)、湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2011)、湖南省教育厅科学研究项目(11B066)
【作者简介】周后兵(1989-),男,湖南株洲人,2008级生物技术专业本科学生。
【通讯作者】贺爱兰(1975-),女,硕士, E-mail: pdheailan@。

湖南人文科技学院,中国湖南娄底 417000
[摘要] 克隆人的泛素结合酶UFC1 (ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)基因,并为实现UFC1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备做准备。方法:采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建并鉴定pGEX-4T-2-UFC1质粒。结果:双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pGEX-4T-2-UFC1重组载体。结论:成功构建泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体,为在原核系统中表达UFC1重组蛋白,并制备多克隆抗体奠定了基础,也为进一步研究UFC1基因功能提供了工具。
[关键词] UFC1基因;克隆;原核表达载体
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A
􀀂泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应。Ufm1(ubiquitin-fold modifier 1)是一种类泛素修饰因子,泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)在Ufm1泛素系统中,是一个类似泛素结合酶E2功能的基因。Ufm1因子通过 Uba5 (E1) 和 Ufc1(E2)共价结合到靶蛋白上[1-3]。目前,泛素和类泛素调节的蛋白质降解过程在生物体中的作用非常重要,因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前,在世界各地的很多实验室中,科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。这些研究对进一步揭示生物的奥秘,以及探索一些疾病的发生机理和治疗手段具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
原核表达质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌BL21(DE3)、人宫颈癌Hela细胞株由本实验室保存。新西兰兔体重( 2~3 kg) 购自中南大学湘雅医学院附属第二医院动物中心。限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ、T4-DNA 连接酶等购自New England Biolabs 公司;Taq聚合酶、DNA marker及琼脂糖等购自TaKaRa 公司; PCR引物合成及测序由上海Sangon公司完成; 凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自杭州新捷生物科技有限公司; RNA反转录试剂盒为promega公司产品;DMEM高糖培养基购自Gibco公司;新生小牛血清为杭州四季青公司产品;其它常规试剂均为国产分析纯。
1. 2 RT-PCR扩增UFC1的cDNA序列
根据GenBank ( NM _016406 ) 中人UFC1基因的mRNA序列,以及pGEX-4T-2载体上的酶切位点,设计并合成一对引物:PUF(上游引物)和PUR(下游引物), 引物的5′端分别加上EcoRⅠ、NotⅠ