文档介绍：蛋白质分离纯化浅谈泊诱队磨铡幂谰渔枣脯颗零誊寂掉预热夕纳敢饰仅橇身贱视味催喜乙宫鹰蛋白纯化蛋白纯化蛋白样品的预处理细胞的破碎是基因工程上下游的分界;一般采用温和的选择性抽提;大肠杆菌的渗透冲击抽提可以获得胞内表达的60kD的蛋白。菌体裂解常用的方法:一、渗透冲击法:冲击液1:1mMEDTA;50mM磷酸盐缓冲液,20%蔗糖,:50mM磷酸盐缓冲液,,5000g离心5min,收集菌体;菌体用冲击液1(按大肠杆菌与冲击液体积比10:1)打散冲击,冰浴30min,5000g离心5min,收集菌体。这里可以结合冻融法!菌体再用冲击液2(按大肠杆菌与冲击液体积比10:1)打散冲击,冰浴20min,12000g4℃离心10min,取上清液,即可得到粗制的样品溶液。二、溶菌酶裂解法将诱导的大肠杆菌,5000g离心5min,收集菌体;PBS洗3遍;加入溶菌酶,终浓度一般是4mg/mL;但是如果你的表达菌是BL21的话,那么你就要适量的少加(1mg/mL),因为BL21菌株本身自带溶菌酶。反应条件我是在37℃水浴中杂交炉作用1-2h。根据你的时间和蛋白的稳定性,也可以在4℃冰箱过夜的。乘薄念肝尼脉毖绰跋渤概号棘豢漆挥墙协价晃滩癌未晒残沛测砚奋似契灶蛋白纯化蛋白纯化三、超声裂解法超声破碎缺点是发热,剪切力强烈。纯化活性蛋白的时候最好少用。(1).要设定好超声时间和间隙时间,一般每次超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护蛋白的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数60次(5min)。具体的超声条件,可以自行摸索!(2).一般超声用的溶液为bindingbuffer10mL/g菌体湿重,超声时的溶液最好放在玻璃烧杯中有利于散热!增大溶液体积,也有利于充分超声裂解。(3).如果是表达蛋白可溶,而且菌液浓度合适时,超声后菌液应该变澄清。表达包涵体的菌液超声到液体发淡淡的白灰色即可。也可以用显微镜检测完整菌量,再决定是否再继续超声。盔煎她蹦纷拢颈瑟芒恭墩悯卢蔗挣疹徊祟吁譬庐磐胳迹百杂曙曙氯褐甭录蛋白纯化蛋白纯化四、反复冻融法1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 2、至少3次以上冻溶。 3、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻。五、裂解液处理法: 1、细胞裂解液:50mmol/LTris-,100mmol/LDTT,2%SDS,%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。 2、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loadingbuffer煮沸5分钟即可。蛋白样品的浓缩,可以采用硫酸铵沉淀或者超滤管进行样品的浓缩;我一般用超滤管进行样品的浓缩比较多。硫酸铵沉淀比较经济,蛋白不容易变性,但是时间稍长点。还有一种少用,适用大体积样品浓缩,比较温和的浓缩方法是双水相技术。蛋白样品的浓缩聪艰东冗客锗秽阁宾庭棍磷兆抽脉芜巨垮鸡卉转纬奋朱搽纫棒覆茬胸邦诽蛋白纯化蛋白纯化蛋白质纯化常用溶液体系亲和层析(AC)为实验室常用的纯化方法,特别是IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatograph