文档介绍：化学修饰的原理
化学修饰的方法学
蛋白质侧链的修饰
蛋白质肽链的交联
亲和标记
蛋白质化学修饰的应用
内容提要
(第九讲)
三、羧基的修饰
用水溶性碳二亚胺作催化剂,通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。
+
+ HX
+
碳二亚胺
形成相应酰胺
重排
四、巯基的修饰
由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基,所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。
常用的有三类:
、碘乙酰胺或环乙烯亚胺
(一)1类试剂是烷化剂,此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸反应。
pH﹥7
碘乙酸
半胱氨酸
副反应:
pH﹥
组氨酸
pH=2~
pH=
甲硫氨酸
(二)2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物,而与其它基团形成的产物则对酸不稳定。
+
pH ﹥5
副反应:
+
pH ﹥7
半胱氨酸
(三)3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸,S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物,也可与巯基反应。
马来酸酐
+
对氯汞苯甲酸
+
S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸
(四)5,5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)也常用于修饰巯基,它与半胱氨酸形成混合二硫化物。
+
pH ﹥
+
DTNB
2-硝基-5-硫代苯甲酸
释放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子在412nm处有
吸收,可用光谱法测定其含量。
五、组氨酸咪唑基的修饰
常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。
1-羧乙基组氨酸
3-羧乙基组氨酸
1,3-二羧乙基组氨酸
+
pH 4~7
+
焦碳酸二乙酯
碘乙酸
用碘乙酸烷化组氨酸
残基可得单取代或双
取代衍生物。
焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.
羟胺可使反应可逆进行,回收组氨酸。
+
pH =7
+
羟胺
六、色氨酸吲哚基的修饰
(一)N-溴琥珀酰亚胺(NBS)常用来修饰色氨酸。
它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。
(二)各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化
最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴,由于溶解度的问题,常用它的类似物二甲基(2-羟基-5-硝基苄基)锍盐。
应注意
的问题
该试剂在水介质、高pH下不稳定,迅速水解为CO2和乙醇。
试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用,形成双取代衍生物。
羟胺不能使双取代物发生可逆反应,而是清除咪唑环。
2-羟基-5-硝基苄基溴
+
pH ﹤
+ HBr
醋酸
+
+ H+ + Cl-
对氯硫硝基苯
带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似,但能产生单一产物,避免了锍盐修饰产物的不均一性,而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。
七、酪氨酸酚基的修饰
四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基,产生可电离的发色基团3-硝基酪氨酸。
色氨酸
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜,用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基,能形成正甲硫盐。
九、丝氨酸羟基的修饰
甲苯磺酰氟(PMSF)可与丝氨酸残基作用。
+
+
四硝基甲烷
3-硝基酪氨酸
试剂
修饰的侧链
Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met
醋酸酐
× × × ×
酰基酸酐
× × ×
醛
× × × ×
N-溴琥珀酰亚胺
× × × ×
碳二亚胺
×
苯异硫氰
× ×
四硝基甲烷
×
三硝基苯磺酸
×
焦碳酸二乙酯
× ×
碘乙酸
× × × ×
环乙烯亚胺
× × × ×
甲苯磺酰氟
×
马来酰胺
× ×
常用重要修饰剂的专一性