文档介绍：:背景:随着近期茶树基因组的发表[1],对茶树的各方面研究将会更加便利。该研究拟从转录组层面,对两种具有明显抗寒差异的茶树品种进行研究。希望从转录组层面,阐述两不同茶树品种产生耐寒性差异的机理。采样方案:选取生长时间相同(最好为1-3年生材料,如果在幼苗期寒冷胁迫下也不会死亡,也可以考虑使用幼苗),耐寒性差异较大的两个茶树品种(A:敏感型,B:耐寒型)。在低温处理前,先将材料移栽回温室,控制室温为25°C,采取每天16h光照周期(110–150μmol_m-2_s-1)培育7天。低温处理分为两种,4°C处理为chillingtreatment(CT),-5°C处理为freezingtreatment(FT),将植物同一时间进行处理,4h和8h后分别取样(同一时间也取在常温下为做处理的样本作为对照组CK(CK包含0h取样))。取完全展开的第三片叶片(可以取其它位置,但需保证所有材料叶片取得位置一致),每组设三个生物学重复,叶片取好后用锡箔纸包好放入液氮中,在放到-80°C冰箱保存,直至提取样品RNA[2].总数据量:2品种*3处理(ck,ct,ft)*3重复*2时间点+2(ck0h)*3重复=42PS:,两种处理(CTorFT)可只选其中一种 ,可根据寒冷胁迫基因qPCR结果,选取表达差异最大的两个时间点,4h,8h仅供参考。(qPCR时间点可设为2h,4h,6h,8h,10h,24h,48h,markergene可选下图中的3-4个,参考文献[2])图1:寒冷处理后基因的表达变化(5个组别分别代表ck,CT4h,CT8h,FT4h,FT8h):找出与耐寒相关的基因极其通路。找出与耐寒相关的可变剪切。:(fastqc)、评估;(Tophat);(cuffinks+RSEM);(RSEM/Ebseq,edgeR);(GO/KEGG);(通过基因表达量,Euclediandistancematrix,热图);(STRINGdatabase)(rMATS)(Juncbase);(Trinity):差异表达分析(A1VSB1 A2VSB2)分别对两物种的2个时间点进行差异分析,筛选出差异表达的基因作为候选分析集合。图2:差异表达基因热图(A1vsA0,A1VSA2 ,B1vsB0,B1VSB2)分别对两物种前后时间点进行差异分析,观察两品种茶树在快速胁迫响应上是否有巨大差异,筛选出候选基因。综合通路富集和功能富集,筛选出与胚胎发育相关的基因。图2:GOanalysis 图3:KEGG通路分析示意图将差异表达基因与转录因子(transcriptionfactors:TF)数据库进行比对,观察有多少TF存在差异表达,在对比其趋势是否与整体差异基因的上调和下调有很强的关联。差异可变剪切分析寒冷胁迫后,可变剪切总数的变化。差异可变剪切分析,分组与差异基因相同。差异可变剪切基因GO/KEGG分析。差异可变剪切基因与差异表达基因的交集情