文档介绍：第八章基因克隆基因克隆(genecloning)或分子克隆,又称为重组DNA技术,是应用酶学方法,在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子,并使之在适当的宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代DNA分子的过程。克隆(clone)一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系,或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤:获得待克隆的DN***段(基因);目的基因与载体在体外连接;重组DNA分子导入宿主细胞;筛选、鉴定阳性重组子;重组子的扩增与/或表达。重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等,一、限制性内切酶的定义、命名和分类 限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性核酸内切酶的来源:细菌的限制-修饰系统。分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。 限制性核酸内切酶的命名。二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称(即具有迥文结构);2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端;3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端,也称钝性末端。4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点,这些酶称为同切酶,如MboIⅠ和Sau3A。三、其它工具酶参考“分子克隆”(Sambrook,)第二节载体-宿主系统一、概述 载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。载体应具备以下条件:能在适当的宿主细胞中复制;具有多种限制酶的单一切点(即所谓多克隆位点)以便外源DNA插入;具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子;载体分子较小,以便体外基因操作,同时载体DNA与宿主DNA便于分离;对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所,适当的宿主细胞,必须符以下条件:对载体的复制和扩增没有严格的限制;不存在特异的内切酶体系降解外源DNA;在重组DNA增殖过程中,不会对它进行修饰;重组缺陷型,不会产生体内重组;容易导入重组DNA分子;符合重组DNA操作的安全标准。二、质粒载体质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子,能自主复制,并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等,通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在,这是筛选重组转化子的基础。作为载体的质粒一般具有以下特点:分子相对较小(3∽10kb);松驰型复制;具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入;具有插入失活筛选标志,便于从平板上直接筛选阳性重组子;质粒能携带的外源DN***段一般较小(<15kb).三、λ噬菌体载体λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体,基因组约为50kb+。线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列,是天然的粘性末端,称为COS位点。λ噬菌体的生活周期:溶菌(裂解)生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑;溶源性生长。λ噬菌体的基因组:左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因;中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区;右臂长约10kb,