大肠杆菌感受态细胞的制备.doc

文档介绍：实验六
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
基因工程的基本路路线本
质粒DNA提取和酶切
PCR
连接
转化
实验目的
掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理,方法和技术. 学会对质粒转化结果的评估.
实验原理
转化(Transformation) 是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传,分子遗传,基因工程等研究领域的基本实验技术. 如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA (电击法, CaCl2法等处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感暂时性的改变成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感 penent cells).
CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形, DNA可吸附在其表面在短暂的热冲击下,细胞可吸收外源DNA. 摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖, ,受体细胞表现标记基因的表型,使转化子与非转化子在选择培养基区分开来转化子在选择培养基上区分开来.
Ampr:抗氨苄青霉素–β内酰胺酶
多克隆位点:外源DNA片段的插入位点
Amps菌株
Ampr
培养基上含有X-Gal和 IPTG时,可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子.
涂布于含Amp的培养基上,可以生长. 涂布于含Amp的培养基上可以生长次日可见白色菌落-- 转化子.
蓝白斑筛选的原理( α-互补)
蓝白斑筛选的原理( α-互补)
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有现在使用的许多载体都带有个大肠杆菌的的短区段其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,-互补. 由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物 X-Gal存在时产生蓝色菌落,,当外源DNA插入到 X Gal存在时产生蓝色菌落因而易于识别然而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,,℃温箱倒置培养白斑筛选如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养 12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落.
材料,设备及试剂
材料
E. coli DH5α菌株: R-,M-,Amp- (转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进和基化酶的突变体( ) 它以容忍外源分子进入体内并稳定地遗传给后代.) pUC19质粒D