文档介绍：一种经济、简单的微生物基因组DNA的提取方法
曾乐平1,周洪波2,黄菊芳1*
1. 中南大学基础医学院,湖南长沙 410083;2. 中南大学资源加工与生物工程学院,湖南长沙 410083
关键词:DNA提取;微生物;基因组
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1672-2175(2005)06-0945-02
获得一定浓度和纯度的DNA是进行分子生物学研究的基础[1]。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提,而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA产物的关键。目前,主要采用的破壁方法有:冷冻研磨法[2]、溶菌酶法[3]、EDTA法[4]等,这些方法一般采用复杂的裂解液体系,并借助蛋白酶K和RNA酶的帮助来获得高质量的抽提产物。由于细胞裂解体系不仅配制十分麻烦,而且部分药品有毒操作危险性大,此外部分药品及相关酶试剂价格昂贵。本文充分利用DNA在不同温度下自身可变性与复性的特性和在高盐与高温条件下蛋白质能够变性并沉淀[5]。以无菌的SDS(c/c =20%)和NaCl(c/c =8%)的混合液作裂解体系,在沸水浴中破壁膜并使得部分的蛋白质变性和DNA变性并得到初步分离;随后在60℃和72℃水浴中使变性的DNA复性和重新凝聚,同时让RNA、蛋白质和细胞壁碎片等杂质降解或沉淀,从而获得高质量的DNA产物。
具体做法如下:
(1)破壁、蛋白质和核酸分离:~ g样品的5 mL EP管中加500~2000 μL裂解液,充分混匀,立即放入沸水浴中并开始计时5~20 min(细胞壁薄且壁外没有荚膜或多糖的微生物,沸水浴时间一般5~10 min;对于那些细胞壁厚或有特殊胞外结构的微生物及杂质含量高的样品,沸水浴时间一般15~20 min),每隔2~3 min颠倒EP管3次;随后立即转入60 ℃水浴中水浴1 h或更长,每隔15 min颠倒EP管3次;接着转入72 ℃水浴中水浴1 h或更长,每隔15 min颠倒EP管3次。
(2)抽提:向EP管中加入等体积的V(氯仿)∶V(异戊醇)= 24∶1,上下倒转溶液15 min后,随后室温静置10 min,接着12000 r/min离心3 min,把上清转入到新的EP管中并重复该步骤一次。
(3)沉淀:-20 ℃冷冻的无水乙醇,上下倒转溶液数次后,放入-20℃或4 ℃冰箱中沉淀1 h或更长。沉淀完毕后12000 r/min离心15 min,收集沉淀。
(4)洗涤:向EP中加入φ=70%的乙醇2 mL,静置10 min,随后12000 r/min离心5 min,弃上清液,重复该步骤一次。
(5)洗脱:室温干燥沉淀物后,加适量无菌双蒸水洗脱沉淀,洗脱液即为基因组DNA提取液。
此法经济、简便、重复性高、适用范围广,可用于海洋和陆地上多种微生物、特别是那些细胞壁厚、有荚膜、产多糖、胞外分泌物丰富的及那些胞外常吸附一些不易洗脱物质(如矿粉颗粒)的微生物基因组DNA的抽提。提取产物纯度高,可直接用于16SrDNA、18SrDNA和23SrDNA等多种基因的扩增。
参考文献:
[1] 张宁, 王凤山. DNA提取方法进展[J]. 中国海洋药物, 2004(2): 40-46.
ZHANG NING, WANG FENGSHAN. Advances of DNA