文档介绍：单克隆抗体技术
实验目的
了解单克隆抗体的制备过程
实验原理
根据肿瘤细胞可以无限增殖、B细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合,通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体,又可以无限增殖的融合细胞。
细胞融合技术:
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
不分泌抗体
长命
分泌抗体
短命
分泌抗体
长命
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
杂交瘤细胞的筛选:
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/
骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
脾细胞
筛选出
不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
DNA
内源性途径(主要途径)
谷氨酰胺 or
单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
H
T
外源性途径(旁路途径)
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( HGPRT )
胸腺嘧啶激酶( TK )
(Thymidine kinase)
B淋巴细胞: HGPRT + , TK+
骨髓瘤细胞: HGPRT - , TK-
存活
死亡
外源性途径(旁路途径)
培养上清中X抗体的检测
克隆化培养
单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测
杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
规模化培养
获得大量单克隆抗体
动物免疫
细胞融合
混合细胞的HAT筛选)
分泌X抗体
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
X抗原
B淋巴细胞
瘤的突变株
培养数天后细胞死亡
无限生长细胞
分泌
X抗体
只有杂交瘤细胞可长期存活下来
BALB/c
杂交瘤技术操作流程图解
一、抗体分泌细胞的分离
,回收血清作为阳性对照。
,研磨,过滤,使成单个细胞。
。
将14%Ficoll400与 33%的泛影葡胺,混匀。取6ml加于离心管底部,然后在其顶部轻轻加上脾细胞悬液,2000rpm离心20分钟,使形成液体界面。
吸取界面上的脾细胞制成脾细胞悬液,存于4℃冰箱备用。
二、细胞融合
肿瘤细胞融合前24h换液一次,培养至对数生长期,收集,洗涤,存于无血清培养基。
无菌条件下融合,置于完全培养基,过夜,重新悬于HAT培养基,接种,培养。
三、特异抗体分泌的检测
取纯化抗原制成适当浓度,加于96孔板底,4℃冰箱过夜。PBS清洗2-3次。
%戊二醛溶液,室温反应15分钟。PBS清洗2-3次。
加入5%的脱酯奶粉,室温封闭30分钟,PBS洗一次,弃去液体。
取待检测抗体,按两板孔的对应位置逐孔加入50μl,37℃水浴60分钟。TP液洗3次后。
加入HPR标记的二抗液,于37℃水浴1小时。
加入底物液各100μl,于37℃反应30-60分钟。
酶标仪读数分析,与阳性血清对照,确定阳性分泌的克隆孔。