文档介绍：蚄血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定羀一、实验目的蒇掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法;蚇掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法;螄了解柱层析技术。莁二、实验原理腿血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要的功能。蒆本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果。:表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出的方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是:中性盐如硫酸铵((NH4)2SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜,并且中和了部分电荷,从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不同,因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀,而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀,利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来,即在半饱和的中,血清蛋白不沉淀,而血球蛋白沉淀,离心后清蛋白主要在上清液中,沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解,由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。薆脱盐膅盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐,常用方法有:透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。羄纯化(离子交换层析)衿离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。芈本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的点正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的。羃脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带的电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。羄纯度鉴定(电泳)艿血清中各种蛋白质的等电点不同,。,在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。螆羆三、材料与方法:、葡聚糖凝胶G-25(SephadexG-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、、、、-、20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、电泳仪、电泳槽。蒈实验方法螅实验流程膄膁纯化羆鉴定薄脱盐芃芈蚈粗提芃莃虿肆DEAE纤维素离子交换层析莆醋酸纤维素薄膜电泳蒃肀葡聚糖凝胶层析袈肅盐析法进行粗分离薃蒁芅袄实验步骤薃盐析:中性盐沉淀步骤袂步骤羇操作袆(1)盐析蚃取离心管一个,,,混匀后室温下放置10min,离心10min(4000r/min)。用滴管小心吸出上清液置于试管中,作为纯化清蛋白之用羈虿(2),振摇使之溶解,作为纯化γ球蛋白用螃荿注意:上层清夜尽量全部吸出,但不可吸出沉淀物。***脱盐:过凝胶层析柱步骤蒄步骤袃操作螀(1)调节层析柱液面衿葡萄糖凝胶G-、,取下恒压储液瓶管塞,小心控制柱下端螺旋夹,使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面膃(2)加样品羂用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液,小心而缓慢的加入凝胶床上面,柱下端用10ml刻度离心管接液,拧松柱下螺旋夹,调节适当流速,使样品进入凝胶床,至液面降到凝胶床表面为止膁(3)、,以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液芆(4)洗脱肂待样品液进入凝胶床内,继续用0