文档介绍：特殊培养法
1)二倍体细胞培养法
二倍体细胞培养法与一般培养相同,关键在于传代,其传代程序为:
1.      吸除旧培养液注入另瓶中。
2.      用温BSS冲洗1次。
3.      %温胰蛋白酶消化,加入消化液量以仅覆盖细胞层即可;作用1~5分钟。
4.      待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大,便终止消化。为防止细胞丢失,可不必再用BSS冲洗,直接向瓶中加入培养液(新旧培养液按2:1新旧混合)。
5.      轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。
6.      按一分为二比例接种培养。
 
2)  支持物培养法
加支持物培养法与一般培养法相同,只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。
1.      支持物制备:如用特***隆薄膜,无菌条件下启封,用剪刀按需要剪成各种不同大小的块,于培养接种细胞前,先置入培养容器中即可;通常多用盖玻片做支持物,用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态,以便装入培养瓶中,然后按如下顺序处理:自来水浸泡24小时—96%酒精30~60 min—蒸馏水浸泡30~60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。
2.      培养法:初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后,可在任何时间取出支持物,做各种观察或实验。
 
3)  细胞分离(克隆)培养
多孔塑料培养板单细胞克隆法:
1.      消化:取健康待克隆细胞,吸出瓶内培养液,加消化液。
2.      低密度细胞悬液的制备:做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液,然后稀释细胞,使之成为1~2细胞/毫升悬液,最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。
3.      接种:先用吸管轻轻吹打细胞悬液,使混悬均匀,。接种时要迅速准确,争取在最短时间内加完,以免培养液蒸发,然后迅速盖好盖板,置CO2温箱培养。
4.      标记:培养6~12小时后,待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后,从温箱中取出,置倒置光显微镜台上,观察和标记下含有单个细胞的孔,置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液,只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基,但不要吸除过多,余少许,以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液,继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时,可进行分离培养。
5.      分离扩大培养:培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔,先吸除旧培养液,用Hanks洗1~2次,继加胰蛋白酶少许,加入量已能覆盖细胞群即可,如过多,应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视,待发现细胞变圆时,%血清的克隆培养基,用吸管轻轻吹打,当细胞离开底物悬浮后,一并吸入管内,移入另瓶或皿中,再补加一定量克隆培养液,置
CO2温箱中继续培养、增殖,使之形成新的细胞群后,即转用常规培养法培养。
 
必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功,为此常采取以下一些措施:
使用适应性培养基或条件培养基(Conditional Medium)。制备方法:
1.      培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞)至半汇合状态时,更换一次培养液