文档介绍：莂实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法膈蚈一、目的:膅(1)初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。肁(2)学****用标准蛋白质混合液制作Ve,Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。膈二、原理:聿凝胶层析法(即凝胶过滤法,gelfiltration)是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法,又叫做分子筛层析法(molecularsievechromatography),排阻层析法(exclusionchromatography)。凝胶本身是一种分子筛,它可以把分子按大小不同进行分离,好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡,使充分吸液膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物后,再以同一溶剂洗脱,在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶内部,流速缓慢,以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。薂凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,不论是天然凝胶还是人工合成凝胶,它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶(agarosegel,商品名Sepharose),人工合成凝胶是聚丙烯酰***凝胶(商品名为Bio-gel-P)和葡聚糖(dextran)凝胶,后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶,它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶,不溶于水,其化学结构式如图17-2所示。膄这种聚合物的立体网状结构,其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后,交联度高的,孔隙小,只有相应的小分子可以通过,适于分离小分子物质。相反,交联度低的孔隙大,适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。芈为了说明凝胶层析的原理,将凝胶装柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt(totalvolume)表示。实际上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,即:芆Vt=Vo+Vi+Vg芄Vo称为“孔隙体积”或“外体积”(outervolume)又称“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体袂积(innervolume),又称“内水体积”,即凝胶颗粒内部所含水相的体积,相应于一般层析法中的固定相的体积,它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得;Vg为凝胶本身的体积,因此Vt—Vo等于Vi+Vg。它们之间的关系可用图17-3表示。莈蚆肆蚁蒈肇蒄蒀薈蒈膆蒃蚇薅蚄节蚇羆莆羁肁莇袄肄膁螈薆螃芁腿羃薁莁芅蚅莀莁蚆膃莃蒁肇洗脱体积(Ve,elutionVolume)与Vo及Vi之间的关系可用下式表示:袅Ve=Vo+KdVi膂式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长短粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可改写成:薀Kd=蒈上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好莃羁蚀蚅肅蚀螀肆蒃螃袀蒇芅蒂有颜色以便于观察,如血红蛋白,印度黑墨水,分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出;Vi可由g·WR求得(g为干凝胶重,单位为克;WR为凝胶的“吸水量”,以毫升/克表示)。因此,对一层析柱凝胶床来说,只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve,就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。羀Kd可以有下列几种情况:袈1、当Kd=0时,则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质(全排阻),洗脱体积等于空隙体积(图中组分Ⅰ)。蚂2、当Kd=1时,Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时,洗脱体积应为空隙体积与内体积之和(图中组分Ⅲ)。芀可以看出,对某一凝胶介质,两种全排出的分子即Kd都等于零,虽然分子大小有差别,但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙,即Kd都等于1,它们既使分子大小有不同,也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质,有它一定的使用范围。羀3、当0<Kd<1时,Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用,扩散渗入,Ve即在Vo+Vi之间变化(图中组分Ⅱ)。芈4、有时Kd>1,表示凝胶对组分有吸附作用,此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值,这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸在SephadexG-,。莄在实际工作中,对小分子物质也得不到Kd=1的数值,特别是交