文档介绍：蒆合肥师范学院新开实验项目试做报告芅单位名称:生命科学系试做日期:2015年1月7日蚀新开实验项目名称蒈用ELISA试剂盒快速测定食物中链霉素膆学时数莆4肃面向专业膂2012级食品质量与安全羇试作教师签名膄张方艳膁实验目的、要求蚁理解链霉素ELISA试剂盒在蜂蜜、牛乳动物肌肉和肝脏中链霉素检测的现实意义;学会使用链霉素ELISA试剂盒。蚇实验原理膅本方法是应用抗原抗体反应原理,采用竞争抑制法构建的一种ELISA试剂。在预包被有在抗链霉素抗体的微孔反应孔内,依次加入链霉素酶标记物、链霉素标准液或样品溶液,然后孵育一定时间,则游离链霉素与链霉素酶标记物竞争链霉素抗体结合位点(竞争性酶免疫分析)。没有结合的链霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质(过氧化脲)和发色剂(TMB)/四***联苯***)加入到微孔中并且孵育一定时间。结合的链霉素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。未显色孔为阳性,显色孔为阴性。检测过程中设置阴性对照、阳性对照或空白对照。可通过目测对比颜色变化进行定性判读,也可加入终止液后使颜色由蓝色转变为黄色,读取在 450nrn处的OD值(选择参比波长≥600nm);或直接在630nm处读取OD值。OD值与样品中的链霉素浓度成反比。薄实验所用主要仪器、试剂及材料肀主要仪器:恒温箱、单道微量移液器,塑料吸嘴,洗瓶,酶标仪,洗板机蒇试剂:链霉素ELISA试剂盒(过氧化脲,发色剂(TMB)/四***联苯***)芇材料:牛乳、蜂蜜、猪肝脏蚂操作步骤:蒀1、将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(20~25℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。膈2、取出需要数量的微孔板,将不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。肄3、洗涤工作液在使用前也需回温。羄4、编号:将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样品孔所在的位置。衿5  加标准品/样品:加标准品/样品50ml/孔到对应的微孔中,然后加入链霉素抗试剂50ml/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。袈6、洗板:小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液300ml/孔,充分洗涤5次,每次间隔30s,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。肅7、加酶标物:加入链霉素酶标物100ml/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min,取出重复洗板步骤6。膃8、显色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15~20min。莈9、测定:加入终止液50ml/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测,请在5min内读完数据),测定每孔OD值。(若无酶标仪,则不加终止液用目测法可进行判定)。蚈实验结果记录与判定:***未显色孔为阳性,显色孔为阴性芁六、思考题肂1、ELISA试剂盒在蜂蜜、牛乳及猪肝脏中中链霉素检测时。是如何保证灵敏度和特异性的?荿羄试做实验小结薄预实验选用的实验材料是猪肝脏,实验结果有无色没有转变为蓝色,说明所选材料中不存在链霉素。蒁开出注意事项腿1、室温低于20℃或试剂及样品没有回到室温(20~25℃)会导致所有标准的OD值偏低。肅2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重