文档介绍：膀实验二:分光光度计的学****之考马斯亮蓝G-250法(Bradford法)测定蛋白质含量定肅一实验目的肄学****分光光度计的基本原理和使用方法,并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。膁二实验原理芈考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。::试管、移液枪、分光光度计等。:蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。***四实验步骤蒄标准曲线制作:取6支10mL干净的试管,按表1取样。摇匀后放置2min,用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作聿管号蝿0薇1芅2膁3袇4羆5羅1mg/ml标准蛋白(ml)(ml)-250(ml)555555蛋白浓度(mg/ml):拟合标准方程:y=+,按下表取样。,,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线0号试管做空白。,,。,。六、实验分析(一)经测量得每毫升测定液中蛋白质的含量很低,是样品本身蛋白含量少还是实验操作造成,还需进一步分析。(二)考马斯亮蓝法测定未知蛋白浓度:优点:1、灵敏度高;2、测定快速、简便,只需要加入一种试剂;3、干扰物质少。缺点:一般分光光度法都有较大的机器误差(重复性较差),为了数据准确,需要每次进行标准曲线的测定。七、注