文档介绍：节莀芀螄芅蒀莇基因克隆实验讲义蒆肄薀螈膈袃蕿腿蚆薂虿薀黑龙江大学生命科学学院莈2010年9月蚅蝿目的基因的克隆与鉴定蚇一、实验目的螆1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。莄2、学****和掌握质粒、T载体的特点。衿3、学****和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。膈4、学****和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。蒈5、学****和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。膃6、学****并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。膃7、学****并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。蕿8、学****并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。羅二、相关知识膆(一)T载体的制备芃pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(T-ACloning)的商业化专用载体,由pΜC18载体改建而成。在pΜC18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再左两侧的3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。罿相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3)PCR等。蚇(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)羄把DN***段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。所谓重组,就是把外源目的基因“装进”载体的过程,即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,patibleend),以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DN***段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。莃相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。莀(三)大肠杆菌感受态细胞的制备膅外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增和筛选,得到大量、单一的重组体分子,这就是外源基因的无性繁殖,或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞,大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。petentcell)是经过一定方法处理后,具有接受外源DNA能力的大肠杆菌,只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。螃相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞的定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCl2、TBaq、PEG)等。蒃(四)重组DNA的转化及重组子的鉴定蒇将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的,一是大量产生重组DNA分子,在完成连接反应后,重组DNA分子往往只有纳克级的量,不易操作和进行下一步的分析,若把重组DNA分子导入到细菌细胞中,细菌细胞可分裂多次产生克隆,克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子,这样重组DNA分子的量就多了;二是对重组DNA分子进行纯化,在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子,连接过程完成以后体系中有多种分子存在,除了需要的重组DNA分子以外,还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DN***段、自身环化的DNA分子和连接上污染DN***段的重组DNA分子,未连接上的载体和DN***段对实验影响不大,因为它们即使导入细菌细胞,因为不能复制,很快就要被细菌细胞中的酶降解掉;对克隆工作带来影响的是后两种分子,因为它们都为环状,在细菌细胞中都能复制,因而都能产生克隆,但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子,每个单克隆都是由一个细胞形成的,因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选,就可以鉴定所需的重组DNA分子。袇所谓的重组子(binant)也叫做转化子(transformant)是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中(如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DN***段)分离出来,并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因,这过程称为筛选(screening)。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同,初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选,直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法;间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法;本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。蒂相关知识点:薃 ①转化(transformation)质粒(plasmid)袈②转染(transinjection)噬菌体(phage)芅③显影注射薅(1)导入的方法④⑤基因枪geneblaster艿⑥脂质体介导法肇