文档介绍：罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序作者:Roche发表于:2009-03-0614:54 来源:丁香园 (Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理:TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radishperoxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯***(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;试剂:试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS)、ProteinaseK工作液(10-20μg/mlin10mMTris/HCl,-8)或细胞通透液(%TritonX-%sodiumcitrate,临用前配制)、苏木素或***绿、DNase1(3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl,,10mMMgCl2,1mg/mlBSA)等。三、实验步骤操作流程图:制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤:,每次5min;(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;;-30min在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;;,处理组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μlDNase1,反应在15~25℃×10min,后面步骤同处理组。,加50μlTUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。;(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。;1