文档介绍：人基因组中鹘谄蔚目焖俑患肷秆表达调节的功能以及基因组自身组织和进化的功能。其。基凶实现/目前,绝大多数基因的转录调节机制研究尚未开展。这主要是合位点,难以获得有价值的信息。秆⒓―训一引魏拖嘤的转录调节因子,研究氲鞍字氏嗷プ饔玫墓媛桑匀皇堑鼻以下几种。厩蟹治觯籪是最常用的力‘法,‘初步确定分析;浅醪饺范ㄌ迥谥匾5鹘谇某S梅椒āD芙险媸档胤囱晏摘要随着人类基因组测序工作的顺利进行,基劂组功能的础恳严得越来越紧迫。基因组的功能主要包括基因转录产物的δ堋⒒有序、协调表达以及基因组形成高级结构是通过氲鞍字实南互作用来完成的。发展新的研究思路,建立有效的技术方法,筛选、鉴定基因组中的鹘谄危巧秆结合蛋臼、揭示基吲表达调节和基因组自身组织规律的基础。由于已有的研究方法难以大量筛选、鉴定鱷,元件,火多数基因的鹘谇晕幢蝗范āA硗猓捎谧B嫉鹘诟兆釉谙赴〉表达水平很低,利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨整酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质,日前已克隆的转录冈子/多,对这些因子的表达模式和鞍字氏嗷プ饔霉媛缮腥狈ψ愎坏难究。利用现有的软件对系牡鞍字式岷衔坏憬蟹治觯词乖体外实验证实没有蛋白质结合的紊希芩鳌鹆康慕转录调节研究的一个重要任务。目前,已发展了多种方法筛选、举定饕恢衿危琷0鹘谠<拇笾挛恢谩⒐δ芑钚浴5ǜ梅椒ǘ訢片段进行连续删切时需要合适的限制性核酸内切酶位点舾行内调节机制,但该方法技术难度较大。另外,以一赫饬街职旆ú荒克隆新的基因片段,只能对已经获得的基圜片段进行分析:对中国协和医科大学博士学位论文
文醇一一一一一一一一一一是获得基因调节信息的一个重要方法,但难以获得合适的突变体。卜它方法。矿改进,结合凝胶阻滞实验,建立了筛选鱦”蔚钠糠椒ā9究隙喔龅鞍字氏嗷プ饔玫墓媛伞5ǜ梅椒ㄐ枥房棺B饥碜拥不包含基因组的序列信息遗传突变分析;砸舺约擦藁方法;芨咝Ц患⑸秆∧苡牒说鞍滋匾旖岷系墓押恕甪核幔序列信息,不能克隆有调节作用的基因组慰扑慊件分析方法捎诨虻鹘诨频母丛有院拖纸锥危籭物信息处理技利用未经纯化的细胞核粗提物就能从人基因纽巾恹速、火量筛选与核粗提物再次进行凝胶阻滞实验。如此重复多轮,欢细患捎抗体和,或纯化的转录因子,,筛选、鉴定的K婊押核幔因天然突变体进行分析,寻找基因突变与基因表达变化的舰律,也且不需要纯化的转录因子。不过,这些寡核‘:酸片段包含基髄纰术的不够完善,该方法难以获得有价值的调节信息,⒓―调控片段方面均有备自的优、缺点,不能相互替代。它们在筛选鹘谄问保蛐什桓撸不能快速、大量筛选基因组中的危蛐栌ご炕淖B因子和抗体,只能分离与己知蛋自结合的巍NQ窘骸鹘谄蔚男路椒ǎ狙芯慷栽械娜ɑ蜃镻技术进行基本原理是,通过超声波将人基因组随机打断,与幼酉嗔后进行全基因组┰觥⒈昙牵环掷左如的琁‘段作为探针,与细胞核粗提物结合后进行聚钒婺簂也泳,回收阻滞带蠵扩增,作为新⋯轮凝胶阻滞实验的探针,细胞核粗提物结合的⒏缓鳌甽6蔚腄部分文库,从中筛选出能与核蛋白特异结合和具有细胞特异结合模式的,
片段在体内很可能也有类似的结合特性。三、筛选具有细胞特异结合模式的鹘￡段菀砸讲本研究包括如下三部分:快速富集与筛选人基因组中的敌巍这‘部分鞘寡突细胞糖蛋白基因的第二个内含子中。卜一二、筛选人表达序列中的肖片段。ü::了元件的人基因纽分获得的具有特异结合特性的蝢,挑选“隹私担特异的岷系鞍椎纳秆『突虻南赴匾煨韵镌ù频研究具有重要意义。、本研究的结果显示,这种方法具有以’点:①能快速、大最鹘谄巍O一、通过┰龅娜嘶蜃镈片段,与核粗捉物结合进行五轮凝胶阻滞实验,回收并扩增阻滞带菇ǜ磺莸,元:部分文库,,建立表达序列巾调节片段的部分文库。从个随机克隆中筛选⋯个能与细胞核粗提物特异结合的人基因组表达巍6个克降进行测序分析,鲂蛄杏隚中的已知序列完全相同,鲂蛄与已知基因的序列均只有一个狢碱基的差异,,隹缭交虻哪诤雍屯庀宰。这样获得的鹘谄斡牖蜃B嫉鹘诠δ芫哂懈苯拥牧O担琲C魅返,片段所调节的具体基因,这些基因处于活化状态,筛选的鳌细胞和细胞的核粗提物分别进行凝胶阻滞实验,比较二者鞍捉岷夏J降囊焱⑾制渲个克隆的凝胶阻÷:明显不同,个克隆的一条类似的弱带具有细胞差畀性。这对细胞中国协和医科大学博士学位论文
克隆、筛选基因组中的叩门巍"谀苌秆【哂邢赴匾旖岷模式的鹘谄巍"鄄僮骷虻ィ恍枰4炕淖B糽子或相应抗体及其它特殊材料和试剂。④改进之后能从大片段垩√初步筛选鹘谄蔚姆椒ā#岷掀渌芯考际酰缱