文档介绍：重组人CD80┐SEA毒素逆转录病毒真核表达载体的构建
作者:李增山隋延仿姜永强雷祚荣尚继栋
【关键词】 CD80
关键词: CD80;葡萄球菌肠毒素A;重组
0 引言
,而T细胞被激活并杀伤肿瘤细胞依赖于两类信号,一类是抗原递呈信号,(al Enterotoxin A,SEA,一种重要的超抗原)的逆转录病毒真核表达载体,使其表达这两个分子,发挥SEA强特异性激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性和CD80介导的第二信号共刺激双重作用,建立SEA-B7-1新双识别系统,启动一种全新的免疫排斥机制,,并将为肿瘤疫苗和基因治疗拓展新的途径.
1 材料和方法
质粒和菌株克隆载体pBluescriptIIKS(+)(简称KS)、大肠杆菌DH5α株、产SEA标准菌株FRI1000及碱基混合物(・L-1 ),XholI,T4DNA连接酶均为BRL/Gibco公司产品.
PCR反应所需Taq酶及Buffer(10×)为Promega公司产品.
引物 G ATGGGC-CACACACGG,下游引物,CG -,SEA上游引物,G GGTGGAGGTAGCGAGAAAAGCGAAGAAA,G CTCGAGTTAACTTGTATATAAATAT,两片段相连的接头部分GlySer Gly Gly Ser Gly Gly Gly已设计入引物内(图1),并经GolgKey软件[1] .
KS-CD80的构建以pLXSN-CD80质粒为模板扩增获得CD80基因,96℃预变性10min;94℃变性60s,48℃退火60s,72℃延伸60s,30循环;72℃延伸10min,[2] ,BamHI,XholI双酶切,37℃反应5h后,75℃,20min结束反应,再次纯化,,XholI双酶切的质粒pBluescriptIIKS(+)行连接反应,16℃过夜反应,连接产物转化宿主菌DH5α,转化菌落提取质粒(碱裂解小量制备).
图1 略
分泌SEA的标准菌株FRI1000DNA的提取参见文献[2].
KS-SEA的构建以提取到的FRI1000DNA为模板扩增获得SEA基因,96℃预变性10min;94℃变性60s,50℃退火90s,72℃延伸90s,30循环;72℃延伸10min,[2] ,BamHI,XholI双酶切,37℃反应5h后,75℃,20min结束反应,再次纯化,,XholI双酶切的质粒pBluescrip