DNA聚合酶┐I Klenow片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂.doc

文档介绍：DNA聚合酶┐I Klenow片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂
作者:徐若华万琪王洪典李兵张巍
【关键词】脑缺血
关键词: 脑缺血;DNA损伤;Klenow片段

1 材料和方法

材料雄性4mo龄左右SD大鼠36只,体质量250~350g,本校实验动物中心提供;DNA聚合酶-I Klenow大片段、biotin-dATP,dGTP,dCTP,dTTP购自美国Gibco公司.
脑缺血模型按文献[1]方法建立前脑缺血模型.

动物分组及组织切片制备 36只大鼠随机分组,实验组每组4只,假手术对照组每组2只,分缺血再灌注1,2,3,6,24和72h6个时间点,各组于相应时间点取脑,将其快速包埋于干冰中,选择视交叉部位切片,片厚10μm,储存于-70℃冰箱备用.

方法玻片晾干,在40g L-1 多聚甲醛固定30min, L-1 PBS漂洗5min×3次;在37℃湿温箱中,用含有10μmol L-1 的dGTP,dCTP,dTTP标记的dATP和40U mL-1 Klenow片段及50mmol L-1 Tris-HCl,10mmol L-1 MgCl ,50mmol L-1 NaCl的混合液()孵育1h, L-1 的PBS液终止反应,然后在PBS/小牛血清白蛋白( L-1 )中洗5min,再将生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC1 300,Sigma)在PBS/小牛血清白蛋白中孵育1h, L-1 DAB在PBS( L-1 ) L-1 H2 O