文档介绍：生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求:正文请统一用:小四号,宋体,;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法4、了解质粒酶切鉴定原理5、学式琼脂糖凝胶电泳,检测质粒DNA的构型、分子量的大小实验原理1、PCR:在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为:(1)变性:加热反应系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。(2)退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35~70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。(3)延伸:溶液反应温度升至中温72℃,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2、质粒DNA的提取:(1)碱裂解法:1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:2)高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA均变性;3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。(2)离心层析柱:1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;2)通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;3)低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3、质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法):1)物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性。2)各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。3)A260/A280比值可以反应DNA的纯度。4、质粒DNA的酶切鉴定:限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶,其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。5、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法:以流程图示意(一)材料:1、PCR:仪器:PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料:菌液:(大肠杆菌DH5a菌株,含靶基因CHD5片段的pMD19-T)、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物2、质粒DNA的提取仪器:恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅材料:含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5αa试剂:溶液S1、溶液S2、溶液S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液Eluent3、质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料:蒸馏水、质粒DNA4、质粒DNA的酶切鉴定仪器:、微量加样枪材料:无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5、琼脂糖凝胶电泳仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料:电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液方法:1、 6ml 12ml将反应管放到PCR仪上进行扩增加入2*-SO100(10μmol/L)-SO101(10μmol/L)1,、,10min弃滤液,,-,放置3-5min离心13000rpm,