Triton X100洗涤剂对抗原包被效率的影响及其对策.doc

文档介绍：Triton X100洗涤剂对抗原包被效率的影响及其对策
作者:李永明, 宋朝君, 张葵, 李琦, 田莹, 金伯泉
【摘要】目的: 观察抗原中残留的洗涤剂成分在间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆时, 对抗原包被效率的影响以及相应的对策。方法: 以卵白蛋白(OVA)、卵运铁蛋白(OT)和本室制备的相应的单克隆抗体(mAb)作为实验模型, 在抗原中加入不同浓度梯度的Triton X100包被ELISA板, 用相应的mAb细胞株培养上清做间接ELISA, 确定Triton X100对包被效率的影响。结果: 当包被抗原中Triton X100的浓度为3×10-6(v/v)时, 可以明显抑制包被效率, 当Triton X×10-4(v/v)时几乎可以完全抑制抗原的包被;在含有一定浓度Triton X100的条件下, 提高抗原的浓度, 或适当增大包被过程中的稀释倍数, 可以明显提高包被效率。结论: 洗涤剂对抗原包被有较强的影响, 在抗体制备过程中, 应尽量提高抗原的初始浓度, 降低洗涤剂的浓度, 设计合理的针对含有洗涤剂抗原的ELISA筛选方案, 是mAb制备成功的关键之一。
【关键词】抗体 ELISA 洗涤剂
随着功能基因组研究的深入, 越来越多的基因表达蛋白作为免疫原用来制备特异性的单克隆抗体(mAb), 但是部分原核或真核表达的蛋白在制备过程中会用到洗涤剂, 当用这些蛋白制备抗体时, 如果不注意其中残留洗涤剂的影响, 往往在间接ELISA筛选时出现“假阴性”结果, 导致大量阳性克隆的丢失, 甚至抗体制备失败。在用含有洗涤剂的抗原包被ELISA板时, 洗涤剂残留过高, 会严重影响蛋白质的包被效率, 但在保证含有一定浓度抗原的前提下, 适当稀释含有洗涤剂的抗原, 反而可以大大提高筛选的阳性率和阳性克隆ELISA检测的A值。我们用本实验室已有的卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)和卵运铁蛋白(Ovotransferrin, OT)及其相应的mAb作为模型, 系统的研究了在抗原中加入洗涤剂Triton X100对包被效率抑制的程度、相应的浓度范围以及解决的方法。
1 材料和方法
试剂和仪器 OVA (Grade Ⅶ)和OT购于Sigma公司, 其相应的mAb antiOVA mAb OT mAb 。Triton X100购于华美生物公司, 96孔ELISA板购于CorningCostar公司, 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体购于Pierce公司, 显色底物ABTS购于Sigma公司, 酶标仪为BioRad公司产品。
缓冲液(1)包被缓冲液: mol/L碳酸盐缓冲液, ;(2)洗液: mol/L PBS mL/L的Tween20;(3)稀释液: mol/L PBS加入体积比为30 mL/L的胎牛血清;(4)底物缓冲液: mol/L柠檬酸盐磷酸盐缓冲液, ;(5)显色液: 5 mg ABTS加入到10 mL底物缓冲液中, 再加30 mL/L H2O2 20 μL, 充分溶解。
方法
确定不同浓度的Triton X100对抗