文档介绍：实验六质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学****和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子,存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被SDS(十二烷基硫酸钠)包盖。当用K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。三、实验材料与试剂1、实验材料大肠杆菌(含有携带插入片段的质粒PMD-18T)2、实验试剂(1)溶液Ⅰ:Tris·HCl()25mmol/L,EDTA()10mmol/L,葡萄糖50mmol/L;(2)溶液Ⅱ(新鲜配制):,SDS1%(W/V);(3)溶液Ⅲ(100ml):5mol/L乙酸钾60ml,(),;(4)***仿-异戊醇(24:1);(5)异丙醇、70%乙醇;四、实验步骤(一)(含PMD-18T质粒),接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液),于37℃剧烈振摇下培养过夜。(由老师完成),于4℃以12000rpm离心1min。,弃去上层培养液,,于4℃以12000rpm离心1min。,使细菌沉淀尽可能干燥。Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和,切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3~5min。℃以12000rpm离心5min,将上清液(400μl)转移到另一离心管中。***仿:异戊醇(24:1)振荡混匀。4℃以12000rpm离心5min,将上清液(300μl)转移到另一离心管中。,振荡混匀,于冰上放置15min。℃以12000rpm离心5min。小心吸去上清液,将离心管倒置于纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。%乙醇溶液洗涤沉淀,振荡混匀,4℃12000rpm离心5min。弃去上清液,在空气中使DNA沉淀干燥(约5-10分钟)。,加1μl胰RNA酶37℃消化RNA30min。%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。五、实验结果我组为第7组,由电泳图谱可以看出,电泳得到3个条带,条带较为清晰。最前面的一条带为超螺旋的质粒DNA(分子量200