文档介绍：目的基因片段的PCR扩增与克隆
1. PCR技术
Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应
它是一种模拟天然DNA复制过程,在有DNA模板、DNA聚合酶(Taq酶)、RNA引物和四种dNTP的情况下,通过高温变性(90℃-95℃,1-2min),低温退火(25℃-37℃,1-2min),中温延伸(60℃-75℃,90 sec-5min),这样反复循环的过程中,在体外扩增特异性DN***段的分子生物学技术。
1)、PCR反应成分:
Taq DNA聚合酶
引物浓度:-
dNTP:一般为50-200μmol/L
Mg2+
模板:PCR对模板的要求不高,单、双链DNA均可,但样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与 DNA结合的蛋白质。
添加剂:DMSO(二***亚枫),提高扩增效率及特异性
(1) 理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍,应按2n的指数方式递增,PCR反应30轮循环后,PCR扩增应达到230个拷贝,约109个拷贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响,实际扩增效率比预期的要低,一般可达106-107个拷贝。
“平台效应”:PCR反应中,当引物-模板与DNA聚合酶达到一定比值时,DNA聚合酶催化反应趋于饱和,即PCR反应不再增加。平台效应在PCR反应中是不可避免的,但一般在平台效应出现前,PCR产物的数量足以满足实验的需要。
(2)PCR反应条件的优化
PCR方法操作简便,但影响因素颇多,因此需要根据不同的DNA模板,摸索最适条件。主要从:
反应的特异性、敏感性、真实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。
①循环参数变性退火延伸
②PCR反应成分
(3)PCR反应引物的设计
引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位。
特异性,扩增性
①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性
②引物长度:15-40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。
③引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%-75%之间。
④引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应避免有回文结构。
⑤二个引物不应有互补序列,特别是3’端应避免互补,以免形成“引物二聚体”,浪费引物。
⑥引物5’末端碱基无严格限制,在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下,其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态,因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等,引物的5’端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
PCR反应系统总体积10 μL,模板DNA的量为植物总DNA 10 ng。
PCR
反应体系(10 μL)
体系各成分
用量(μL)
sterile water

10×Taq buffer

引物1(20p m