文档介绍：毛柄金线菌中 SRPK1 的初步探索
(理学院,应用化学系,应用化学专业(食品科学方向) 李少权)
(学号:2000141101)
摘要:本文利用超声波破碎将毛柄金线菌细胞内的蛋白质释放出来,经两步 NH4SO4
沉淀和一步 MgCl2 沉淀将所需研究的蛋白初步提纯分离后,通过 SDS-PAGE 电泳将不同分
子量大小的蛋白质分离,利用考马斯亮蓝染色法以及蛋白质 Western 印迹法初步探索毛柄金
线菌内是否含有 SRPK1。
关键词:毛柄金线菌,SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色法,Western 印迹法
教师点评:该项目实广东省自然科学基金项目的一部分,SR 蛋白激酶(SRPK1)的研
究相关报道不多,特别是在真菌细胞中,除酵母外,未见有人报道发现有 SRPK1。该课题
的研究处于国际前沿,难度大,该论文用 SDS 电泳及免疫印迹法技术检测到在毛柄金线菌
(Flammuliina velutipes)存在有 SRPK1 类似激酶的阳性反应。为进一步从毛柄金线菌获得
相关基因打好了基础。该论文工作量大,研究方法科学,结果准确,成绩显著。(点评老师:
郑宗坤,副教授)
1 前言
RNA 剪接研究中重大的发现之一是选择性剪接,即在同一个基因中,其剪接位点和形
式可以改变,从而导致一个基因能产主多个具有明显差异的蛋自产物。选择性剪接是如何进
行的呢?研究表明,SR 蛋白作为一种剪接因子在选择性剪接的进行中起着重要的作用。SR
蛋白主要与 mRNA 前体中的特异序列结合,从而帮助其他剪接因子识别正确的剪接点[1]。
从对剪接因子聚集的核斑点进行研究中观察到的一个最有趣的现象是其在细胞周期中
发生组组装和去组装,即它们在细胞分裂间期,成典型的斑点状结构;随着细胞进入有丝分
裂,班点逐渐分散,到有丝分裂中期时,斑点消失;当分裂完成后,斑点又在两个子细胞中
重新出现。这一现象表明,剪接因子聚集的核内斑点与那些在细胞周期中发生了组装和去组
装的细胞器如染色体和核膜类似,可能也存在类似的调控机制。由此出发,终于鉴定,纯化
并克隆出了一种新的特异于 SR 蛋白的激酶--SRPK1[2]。
丝氨酸/精氨酸(SR)蛋白特异性激酶(serine/arginine protein-specific kinase,SRPK1)是 Gui
等在探寻剪接因子在细胞周期过程中重新分布的机理时鉴定并克隆出来的。SRPK1 是一种
对含有 SR 结构域的剪接因子具备高度特异性的激酶,因为其只对底物中的精氨酸进行识别
1
和磷酸化。SRPK1 的功能分析表明,过量的 SRPK1 抑制体外剪接反应,SRPK1 对 SR 蛋白的
磷酸化是 RNA 剪接的先决条件,磷酸化可能使 SR 蛋白用以调节剪接体组装的步骤;而去磷酸
化则可能对剪接体的激活和剪接体的解体都是十分重要的。SRPK1 的发现不但揭示了其对
SR 蛋白的磷酸化,而且证明了剪接因子在细胞周期中发生组装和去组装的原因[3]。有研究表
明 SRPK1 分布在细胞质和细胞核中[4],在一些动物和植物的细胞中已发现有 SRPK1,但真菌
细胞还未有相关的报导。本实验将毛柄金线菌中的 SRPK1 进行粗步提纯,然后采用十二烷
基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将粗蛋白样品进行分离后,结合考马斯亮蓝染色
法及 Western 免疫印迹法对毛柄金线菌中是否含有 SRPK1 进行初步的探索。
2 原理
SDS-PAGE 分离原理
所有带电离子或基团在电场中都能泳动。除了在其等电点以外,蛋白质在任何 pH 下都
带净电荷,因而也能泳动,其泳动速度取决于所研究的蛋白质的电荷密度(电荷与质量的比
值);电荷密度越大,分子泳动的速度越快。因此,给溶液中的蛋白质混合物施加电场将导
致不同的蛋白质以不同速度朝向某一电极泳动。由于所有蛋白质最初分布于整个溶液中,故
所获得的分离效果极低。区带电泳是这一方法的一种改进,它将待分离的蛋白质分子的混合
物置于距电极适当距离的狭窄区域或区带上,以便在电泳时,迁移率各不相同的蛋白质以不
连续的区带移动,从而使它们在电泳过程中逐步分离。理论上,若蛋白质的相对泳动率明显
不同且泳动的距离又足够大,则不同的蛋白质很容易通过形成不同的区带而得到分离。然而,
实际上自由溶液中的区带电泳存在着某些缺陷:首先,电泳引起的任何热效应能引起液柱的
对流扰动并破坏正在分离的蛋白质区带;其次,扩散作用将不断地使蛋白质区带加宽,而且
在电泳结束后,这一作用还在进行。因此,为了减小这类效应,蛋白质的区带电泳几乎不在
自由溶液中进行,而是在具有起稳定作用的某种支