文档介绍：转 phbB 基因衣藻的构建与分子检测

(生命科学学院生物技术专业温健聪)
(学号:1999302235)

内容提要:实验通过“珠磨法”将外源基因 phbB -849 中,筛选出转 phbB
基因的转基因工程藻。运用 PCR 技术和 Southern Blot,在 DNA 水平对转基因衣藻进行了分
子检测。
关键词:衣藻;phbB 基因;PCR;Southern Blot
教师点评:该论文将外源基因 phbB 转入到莱茵衣藻中,并对筛选出的转基因藻进行了
分子检测。实验设计合理,方法可靠,得到了较好的实验结果,是一篇较好的本科学位论文。
(点评教师:胡章立职称:教授)

引言
由于现有的塑料制品多数不能被微生物所降解,所以大量的塑料废弃物造成了日益严重
的“白色污染”,许多国家已开始限制使用这类塑料用品。为了净化人类的生存环境,立足
从源头解决污染问题,研制与开发生物可降解塑料已迫在眉睫。PHB(聚-β-羟基丁酸
polyhydroxybutyric acid,简称 PHB)是一种可被微生物完全降解的高分子聚合物,具有良好的
生物相容性与热塑加工性,是一种理想的塑料原材料。构建能高效表达 phbA、phbB 以及
phbC 基因的转基因藻,可通过藻类生物反应器大量生产 PHB。
最初生产 PHB 是通过微生物发酵的方法,但是发酵底物使其生产成本大大提高;而转
基因植物生产 PHB,虽然光合产物解决了发酵生产 PHB 需要的底物成本高的问题,但是由
于高等植物生长周期长,占地空间大,不适于集约式工厂化生产,因此,用转基因植物生产
PHB 途径也受到了一定的制约。本实验室采用的真核绿藻(Chlamydomonas reinhadtii)被
称为“光合酵母”,由于它能象高等植物一样进行光合作用而产生大量的光合产物,所以用
转基因衣藻生产 PHB 一方面解决了发酵底物问题,同时,由于衣藻繁殖速度快,能象细菌
那样进行大规模工厂化培养,通过采用无细胞壁的突变株作为 HOST 品系,能很容易从藻
中分离 PHB。
本论文就是在构建了转 phbB 基因的转基因工程藻的基础上,对筛选出的转基因藻进行
分子检测。
1、材料和方法
藻株和质粒
质粒 PUB8 由中科院植物研究所宋艳茹教授惠赠(其中有 phbB 基因).p105、p124、
XL1()-849(莱茵衣藻)由香港城市大学植物分子生物学与环境生物
技术实验室提供.
质粒的提取、酶切、连接以及连接产物的转化
质粒的提取冻存菌接种于含 Amp 的平板,取含 Amp 平板上的单一菌落接种于
10-20mL LB 培养液中,37℃,200-300rpm 摇床上培养 12h;取菌液至 EP 管(
离心管),4℃、12000g、30sec 离心收集沉淀;弃上清,加入预冷的溶液Ⅰ100ul,重悬沉淀。
加入现配的溶液Ⅱ200ul,颠倒 4-5 次,冰浴 10min(溶液Ⅱ要现配现用);加入预冷溶液
Ⅲ(倒置摇动 10sec),然后冰浴 3-5min,4℃、12000g、离心 5min,取上清,加入等体积
的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽