文档介绍：摘要识别蛋白质其实是对生物体内所有表达蛋白质种类的测定,鉴于复杂生物体表达蛋白质有几十万种,有效的分离蛋白质混合物对于后序正确的鉴定极为重模高通量研究蛋白质组学的今天,近年来,高效液相色谱和毛细管电泳的发展为蛋白质和多肽的分多维色谱分离平台建立过程中最重要的两方面一是选用何种分离模式联用,人类基因组测序计划完成后,蛋白质组学研究被提上了日程。蛋白质组学包括表达蛋白质组学和功能蛋白质组学两部分内容。表达蛋白质组学研究基因编码所有蛋白质的识别和定量,及其在细胞中的定位和在后转录阶段进行的修饰。而功能蛋白质组学主要研究蛋白质之间的相互作用,确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用,说明蛋白质结构和功能间的相互关系。要。两维聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用蛋白质等电点和分子量的差别进行正交分离的分析方法。从年建立至今因其无法比拟的高分辨率在蛋白质组学的研究中始终占据重要地位。然而籇灿幸恍┠岩钥朔娜毕荩如有限的动态范围和分离样品中分子量差别较大的蛋白质,低含量的蛋白质信号蛋白和转录因子约笆杷缘鞍字膜蛋白和跨膜蛋白芰喜睿硗其操作过程费时费力,自动化程度低,并且难于实现与质谱的直接联用。在大规庑┤毕萑找婷飨缘叵拗屏怂9泛的应用。快速,高效,自动化程度高的新型分离技术亟待发展与应用。离分析提供了新手段。然而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限,为了对复杂蛋白质样品进行更有效地分离分析,研究者尝试联用色谱电泳等分离手段以提高分辨率。与一维分离模式相比,多维分离技术的最大特点是拥有更大的峰容量。根据建立的数学模型,多维分离系统的峰容量应为其包含各单维分离模式峰容量的乘积。即如果联用的迦萘糠直鹞,⋯⋯,则总峰容量为×⋯。极大的峰容量对于有效分离复杂样品是十分有利的。二是如何实现联用。各种分离模式只有分离机理正交才能最大限度的提高峰容量,同时也要兼顾到不同分离模式所适用样品,使用流动相间的匹配问题。如何实现联接不仅包括分离模式内部的联接,最后一维与检测器的联接也要考虑在内。一维色谱及电泳分离模式多样,多维联用可在色谱内部,电泳内部及色谱电泳之间进行。研究者要根据实验室的具体情况及样品来选择合适的联用模式,并实现联接以应用于实际分析。复旦大学博士学位论文
组成的两维及三维分离系统及其在蛋白质组学研究中的应用。第四章发展了反相液相色谱毛细管电泳串级质谱平台。首次实现了行发展的重力进样接口和绘接口联接,蚆—。传统—接口使用时,电泳两端只能施加负高压,我们所设计的新型进样接口可在正高压下使用,它与狹接口一起保证在进行快速电泳分离的同时电泳无论是籇故嵌辔追掷爰际酰鞍字恃肪掷牒蠖家=肷物质谱进行鉴定。生物质谱常采用的两种电离技术是电喷雾电离突甯助激光诱导解吸电离7掷牒蟮碾亩位虻鞍字世胱踊蠼胫势祝相应的质量分析,所得数据送入蛋白质数据库搜索并获得相应的蛋白质身份。建立多维色谱分离平台,并将之与生物质谱联用以分析生物体组织或细胞蛋白质表达谱是本论文所涉及的最重要的工作。论文第一章对多维分离技术进展进行了综述,主要包括由不同单维分离模式第二章建立并优化了在线两维液质联用分离分析系统,并应用于肝脏样品和肝脏细胞核表达蛋白质组的分析。利用标准蛋白质混合样品对两维系统的检测限和分离能力进行了考察,分别优化了强阳离子交换台阶式盐进样洗脱条件和反相分离所采用的连续梯度洗脱条件,比较了商品预柱与实验室自制预柱对样品的捕捉及富集能力,并将自制预柱替代商品预柱用于实际样品分析。利用.—/系统对顺序提取的鼠肝蛋白质样品进行了鉴定,水溶性蛋白质鉴定出觯蛩靥崛〔糠旨ǔ个,共鉴定出龅鞍字剩同时利用该系统分析了∈蟾卧嗪说鞍字时泶锲祝宕尾⑿蟹治龉布ǖ到龅鞍字省第三章发展了狹琈蚆./并行鉴定技术,并与两维液相分离联用以分析复杂蛋白质样品。隕离子化机理显著不同,两者对同一样品进行分析时,获得的信息既可相互确认又能形成补充。目前为止没有质谱可同时进行甅疢蚆./测定,我们发展的并行鉴定技术旨在实现甅疢蚆./同时检测,从而挖掘出更全面的样品信息。实验中利用柱后分流将/和甅刚连接到同一色谱分离过程之后,一部分进行甅疢治觯硪徊糠值阊贛靶板上利用狹疢治觥@酶貌⑿屑ㄏ低扯匀烁巫橹鞍字侍崛⊙方辛瞬定,实验结果显示并行鉴定技术无论在蛋白质鉴定数量还是可信程度上都优于单独串级质谱分析。两维系统与串级质谱的联接并将之应用到实际生物样品分离鉴定工作中。利用自流分可持续稳定地点在邪迳稀?焖倭轿低彻ぷ魈跫ń涌诓僮魈跫复旦大学博士学位论文
冻干,酶解,各组分经过两维色谱分离后在线进行甅疢治觯电泳分离条件,点样频率等进行了优化。整个两维体系的分离时间只相当于一维反相分离所需时间,而峰容量比一维反相提高了约一个数量级。利用该快速全二维分离鉴定系统,我们分析了肝癌高转移潜能小鼠肝脏表达蛋白质,分钟分离获得张串级质谱图,鉴定了条信