文档介绍：摘要乙酰胆碱酯酶畉,,.欠植加诩棺刀锏ḿ能神经节、线虫及无脊椎动物神经肌肉接头处的重要水解酶。在生物体内,它能特异性催化乙酰胆碱的水解反应,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。由于有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂能特异性抑制乙酰胆碱酯酶的活性,阻断乙酰胆碱的水解,使乙酰胆碱在突触间隙积累并引起昆虫中毒死亡,因此乙酰胆碱酯酶是有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。东亚飞蝗,是我国重点防治的迁飞性农牧业害虫。目前,有机磷杀虫剂仍然是杀灭东亚飞蝗的主要化学农药。在长期的选择压力下,东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性种群已经产生。对东亚飞蝗自然种群乙酰胆碱酯酶敏感性的对比研究结果显示:抗性种群乙酰胆碱酯酶对毒死蜱、内吸磷、对硫磷的敏感性分别是敏感种群的倍、倍和倍。因此,不敏感型乙酰胆碱酯酶很可能是引起东亚飞蝗杀虫剂抗性的机制。尽管不敏感型乙酰胆碱酯酶已被证明是引起许多昆虫抗药性的重要机制,但对东亚飞蝗而言,由于未知其乙酰胆碱酯酶基因序列,因此不敏感型乙酰胆碱酯酶产生的分子生物学机制尚不清楚。本研究通过比对昆虫乙酰胆碱酯酶蛋白质序列,找出其氨基酸保守区域,兼顾东亚飞蝗密码子使用频率,设计简并引物,┰龆欠苫纫阴5ḿ铛ッ富保守片段;以东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因保守序列为依据,设计基因特异性引物,采用技术扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶全长;在得到东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶全长的基础上,通过基因干扰和基因表达研究东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的功能。东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其功能研究,有助于从分子水平上阐明东亚飞蝗有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂抗性产生的分子生物学机制,对于开发新型化学及生物杀虫剂具有十分重要的意义。阴5ḿ铛ッ富虻目寺以东亚飞蝗基因组D0澹酶菀阴5ḿ铛ッ副J匦蛄猩杓频募虿⒁物进行笛椋竦昧艘桓的基因片段。生物信息学分析表明,该片段编码的氨基酸序列与德国小蠊サ南嗨菩裕胧卷书虱サ南嗨菩裕牒谖惨恫有%的相似性。在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶保守序列基础上,设计基因特异性引物,采用技术克隆了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因,登录到锹己盼狤中文摘要
克隆到的东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因序列长,开放阅读框长,共编码霭被幔’.和朔潜嗦肭直鸪和进化树分析表明,该基因的编码产物属于鸵阴5ḿ铛ッ福湟患督峁咕有如下乙酰胆碱酯酶的共同特征:①保守的催化三联体活性位点,即,虷:②胆碱结合位点:③形成链内二硫键的霭腚装彼瓹、.、.,东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶有霰J氐陌腚装彼珻虲乏形成第一个链内二硫键的第一个半胱氨酸;④形成催化谷内衬的个芳香族氨基酸残基、,有个在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶中保守、、:⑤包含丝氨酸活性位点的序列,该序列在所有胆碱酯酶中保守。欠苫纫阴5ḿ铛ッ赣胗谢卓剐灾涞墓叵将体外转录制各的乙酰胆碱酯酶基因特异性⑸涞蕉欠苫人牧淙舫血腔,检测榈嫉幕虺聊榭觥J凳庇ü舛縋结果显示,在水平上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了.%;峁允荆诘鞍字仕上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了.%;酶活测定结果显示,乙酰胆碱酯酶基因干扰组东亚飞蝗的乙酰胆碱酯酶比活是对照组的%。说明扇拍芴匾煨沉默东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的表达。马拉硫磷敏感性测定结果显示,干扰组蝗虫半数致死剂量为罚对照组为./头,,说明该乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂作用靶标和东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性相关基因。欠苫纫阴5ḿ铛ッ傅谋泶构建了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶真核表达载体,获得了高表达毕赤酵母菌株,经%甲醇诱导培养九天,。毕赤酵母表达上清经%饱和度硫酸铵沉淀和甌亲和层析后,可以获得纯净的重组乙酰胆碱酯酶,其比活可达ā对重组乙酰胆碱酯酶的酶学特性研究显示,该酶对硫代乙酰胆碱的催化活性高于硫代丁酰胆碱,,当抑制剂的浓度为甃时,酶活可分别被抑制%和%。关键词:东亚飞蝗,乙酰胆碱酯酶,扇牛挂┬裕铣嘟湍副泶重庆大学博士学位论文、、蚘Ⅱ
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