文档介绍：琼脂糖凝胶电泳检测DNA
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一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,检测质粒DNA或PCR产物。
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二、原理
带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法
泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下,单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比,与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率,在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率
影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度
DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质:琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶
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琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应
在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型
琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子
可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子,常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系
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琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数
凝胶浓度(%)线性DNA长度(bp)
1000~30000
800~12000
500~10000
400~7000
200~3000
50~2000
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质粒DNA分子有三种构型,DNA、OCDNA和LDNA,这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同,CDNA泳动最快,其次是LDNA,最慢的是OCDNA
EB:即溴化乙锭,它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测10ng 的DNA
注意:EB是一种诱变剂,操作时一定要注意安全,必须戴塑料或乳胶手套
CCCDNA
LDNA
OCDNA
电泳方向
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶,由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成
可以分离小片段(5~500bp)DNA分子
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用:
蛋白质分子的分离鉴定
蛋白质分子量的测定
核酸的分析
核酸序列测定
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三、仪器、材料与试剂
微波炉
琼脂糖凝胶电泳系统
凝胶成像系统
质粒DNA
DNA marker
50×TBE
6×凝胶加样缓冲液
琼脂糖
1%溴化乙锭溶液
溶解琼脂糖
分离质粒DNA片段
检测质粒DNA片段
电泳样品
DNA相对分子质量标准物
电泳缓冲液
沉淀DNA并起指示作用
电泳支持介质
嵌入DNA中,在紫外灯下显色
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四、实验步骤
将1g 琼脂糖加入100ml 1×TBE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解(冷却到60℃,加入5μl的1% EB,并摇匀),则为1%琼脂糖凝胶液
用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入,室温冷却凝固
充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加1×,小心垂直向上拔出梳子
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