琼脂糖凝胶电泳检测DNA.doc

文档介绍：琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验类型:验证型
目的和要求
原理
琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法,其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同,DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子,其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭(有毒!),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种光络合物,在254~365nm波长紫外光照射下,呈现桔红色的荧光,因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰(蓝)作为双色电泳指示剂。其目的有:①增大样品密度,确保DNA均匀进入样品孔内;②使样品呈现颜色,了解样品泳动情况,使操作更为便利;③×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同,二甲苯氰(蓝)则与4bp的DNA相同。
线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系
琼脂糖凝胶的百分浓度(%)






操作方法
(1)琼脂糖溶液的制备:%琼脂糖,在沸水浴中煮沸直到完全溶解;将溶液冷却到约50~60℃,。
(2)将琼脂糖溶液倒入电泳支架上,放上梳子,梳子须离开电泳支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后,小心拔去梳子,将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中,电极缓冲液应淹没过胶。
(3)电泳
取薄膜,滴加上样缓冲液和DNA样品5~10ul,混匀,用微量移液器加入样品槽中。点样端朝负极,通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处,取出凝胶,紫外灯下检测。注意:
溴乙啶是一种强致突变剂,在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道,应进行如下处理: 分离线状DNA分子的有效范围(kb) 60~5 20~1 10~ 7~ 6~ 4~ 3~
方法I:(1)每100ml溶液中加非离子型多聚吸附剂Amberlite XAD-;
(2)室温下放置12小时,不时摇动;
(3)用新华1号滤纸过滤,弃滤液;