文档介绍：BMP2和FGF2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张为西, 陈松林, 姚晓黎, 卢锡林, 周琛, 冷雁, Xingming Shi
【摘要】目的: 观察骨形成蛋白(BMP2)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化的影响。方法: 取3~18月雄性C57BL/6J小鼠(共50只)的骨髓细胞, 分离贴壁培养后, 用免疫磁珠法纯化, 并鉴定为MSCs后, 再进行贴壁培养24 h后, 分别在成骨细胞诱导培养液中加入100 μg/L BMP nmol/L FGF2持续诱导7、 14、 21 d后, 进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测, Vonkossa染色以及茜素红染色, 并用递转录荧光定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因(Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen1、 osteocalcin)的表达情况。结果: BMP2刺激组的ALP活性以及钙化结节明显高于对照组, Runx2/cbfa1, ALP, collage1, osteocalcin的mRNA呈高表达; FGF2刺激组的ALP活性以及钙化结节也高于对照组, Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen
1、 osteocalcin的mRNA表达量也高于对照组, 但不如BMP2明显。结论: BMP2和 FGF2在不同程度上促进体外培养的小鼠MSCs向成骨细胞方向分化。
【关键词】小鼠; 骨髓间质干细胞; BMP2; FGF2
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能, 可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞甚至神经细胞分化, 已成为骨组织工程的理想种子细胞。骨形成蛋白(bone ic proteins, BMP)属于TGFβ超家族成员, 是骨组织工程中应用最广泛的信号蛋白, 其中BMP2是最重要的成骨形成调控因子。而碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, FGF2, bFGF)也是软骨、骨生长和分化的一种主要调控因子, 在骨的生长和发育中起到一定的作用。然而, 在对大鼠、小鼠、兔、人等骨髓基质细胞、间质干细胞向成骨细胞分化的研究中, BMP2和FGF2所起的作用, 结果不甚一致[1-4]。我们用外源性BMP2和FGF2刺激小鼠来源, 经纯化和鉴定后的MSCs, 观察BMP2和FGF2对MSCs向成骨细胞方向分化的影响。
1 材料和方法
材料 C57BL/6J 小鼠50只(每次实验使用5只, 体质量18~26 g), 购于美国Jackson实验室。每只笼饲养3~5只, 标准啮齿类动物饮食, 动物的处理和饲养均遵循美国NIH指南。倒置相差显微镜(Axiovert35, Zeiss, Germany); 多功能分光光度计(VICTOR3TMV, PerkinElmer); 扫描仪(Cannon, USA Inc); 荧光定量PCR仪(MJ Research); One
StepTMNBT/BCIP溶液(Pierce, Rockford, IL); TRIzol试剂(Inritrogen 公司); Taq man 逆转录酶试剂盒和SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems); BMP2(PEPRO TECH公司); FGF2(RD公司); 硝酸银溶液(Fluka); 其余所有化学试剂均购于美国 SigmaAldrich公司。
方法
小鼠MSCs的体外分离、扩增、纯化和鉴定按参考文献[6]的方法进行。
MSCs的成骨细胞诱导培养取体外培养扩增的第4代MSCs, 以1×104/cm2的MSCs 细胞密度种植在96孔板上培养, 共分3组, 每组3个培养孔, OS对照组: 培养第2天加入成骨细胞诱导培养液(osteogenic media, OS)诱导(DMEM, 20 mL/L胎牛血清, 5 mmol/L β甘油磷酸, 50 μmol/L 抗坏血酸), OS+BMP2诱导组: 在OS基础上再加入100 μg/L BMP2。OS+FGF2诱导组: nmol/L FGF2, 持续诱导, 隔日换液。7 d后, 进行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定。14 d 或21 d后对于钙沉积用von kossa 染色或/和茜素红(Alizarin Red S, ARS