DcR3对人肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的作用.doc

文档介绍：DcR3对人肺成纤维细胞合成Ⅳ型胶原的作用
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:杨洋, 乔俊华, 安继红, 张越, 吴春风, 郏博, 马忠森
【摘要】目的: 探讨诱骗受体3(DcR3)对人肺成纤维细胞(HLF)合成Ⅳ型胶原的作用。方法: OverPCR方法构建DcR3的真核表达载体, 脂质体法转染HLF细胞, Western blot检测HLF细胞合成Ⅳ型胶原的含量。结果: 成功构建了pvax1DcR3真核表达载体并转染HLF细胞; 转染组细胞Col Ⅳ表达量明显升高, 从12 h开始持续到72 h, 与对照组比较差异有统计学意义(); 而转染+抗体组与对照组比较差异无统计学意义(); 转染组不同时间Col Ⅳ表达量有统计学意义(F=, )。结论: DcR3促进HLF细胞合成Ⅳ型胶原的能力, 可能是加速肺纤维形成的因素之一。
【关键词】 DcR3基因; HLF; Ⅳ型胶原
诱骗受体3 (decoy receptor 3, DcR3)是一个新发现的具有免疫抑制作用的分子, 与多种自身免疫性疾病、肿瘤、弥漫性肺间质疾病等相关[ 1, 2 ]。有文献报道DcR3在肺纤维化患者外周血单核细胞中高度表达[3], 但是DcR3在肺纤维化的发病过程中, 到底扮演怎样的角色, 目前尚不明确。本研究拟通过检测分析转染DcR3后, 肺成纤维细胞合成
Ⅳ型胶原的能力, 探讨DcR3对肺纤维化形成的作用。
1 材料和方法
材料人肺成纤维细胞(human lung fibroblast, HLF)购自上海细胞研究所。真核表达质粒pvax1购自天根公司; 原核表达质粒pET28a(+)DCR3(含酶切位点BamH I和EcoR I), 为本室构建并保存。Mouse anti human DcR3自备。小鼠抗人Col Ⅳ单克隆抗体(mAb)和相应二抗及DAB显色液购自武汉博士德生物试剂公司。PCR引物、 Primer STARTM HS DNA Polymerase、 DH5α、 DNA 连接酶、限制性内切酶BamH I和EcoR I、核酸分子质量标准、购自天根公司; M2000脂质体、细胞培养试剂购自Invitregen公司; 质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司; PVDF膜购自Roche公司, RPMI1640 培养基细胞培养试剂购自Sigma 公司。
方法
引物设计与合成参考GenBank 收录的DcR3序列和信号肽序列(AF104419), 设计引物如下: A1: 5′3′(斜体为BamH I酶切位点); A2: 5′
ACGGCTGCGGCTGGGTCAGGTC3′; B1: 5′GTG3′; B2: 5′CCGAATTCTCAGTGCACAGGGAGGAAGCG3′(斜体为EcoR I酶切位点)上述引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。
PCR 扩增人DcR3cDNA 通过overlap PCR方法将信号肽和目的基因相连, 扩增出完整的DcR3cDNA。具体如下: 以含信号肽质粒为模板, 以A1、 A2为引物扩增信号肽序列; 以含目