文档介绍：ELISA法对乙型肝炎两对半检测结果影响因素的探讨
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【关键词】酶联免疫吸附试验;乙型肝炎;影响因素
酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙型肝炎(下称乙肝)免疫学标志物问世以来,由于其简便、灵敏、特异性高的优点,成为基层医院对乙肝诊断分型疗效观察的主要手段[1,2],但由于其自身方法学上的限制,不同血清物质变化及实验室因素易造成各种错误结果。笔者综合资料及临床实践,对影响乙肝“两对半”检测结果的因素,报告如下。
1 样本采集与处理的影响
(1)标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性,严重溶血标本禁用。(2)采血试管洗涤不彻底、反复使用交叉污染。塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空采血管。并使用非抗凝标本。(3)标本凝固不全,正常血液采集后30 min~2 h开始凝固,18~24 h血块完全收缩。在工作中,有时为了快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉,易造成假阳(阴)性结果。因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管中加提取。
2 试剂的影响
(1)乙肝两对半试剂厂家较多,不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别。资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性也不尽相同,有的厂家酶标板孔间A值差>15%,标记酶的活性及显色液的稳定比较差[3]。使用劣质试剂必然导致结果的假阳性或假阴性,选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。(2)不同方法学的检测试剂会使两对半结果出现一些不同。例如:在实际工作中常用ELISA法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)结果为阴性,而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外,还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异,建议试剂厂家对试剂的制备应该考虑亚型及浓度的问题。
3 操作技术的影响
(1)加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会,建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。(2)温浴影响。96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异。干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入。(3)洗涤是ELISA
操作的重要环节,手洗条件一致性较差,对结果影响较大,半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性。所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。(4)肉眼判断结果时,显色浅不易观察,影响结果的准确性,必须使用酶标仪检测结果,以保证结果一致性。