ImmunoAIF△1480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用.doc

文档介绍：ImmunoAIF△1480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:韩涛, 张勇, 孙书明, 任君琳, 李伟, 郭张燕, 孟艳玲, 杨安钢
【摘要】目的: 观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。方法: 利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C末端结构域编码区重组, 然后将R9AIF△1480基因与pCMVe23sFv载体重组, 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480真核表达载体。用脂质体法转染CHO细胞, 经G418筛选, 建立稳定转染的细胞株, 通过RTPCR、 Western blot、流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性。结果: 经过酶切鉴定与测序证实, 带有ImmunoAIF△1480基因的真核表达载体构建成功, 经RTPCR、 Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达, 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1480对HER2阳性肿瘤细胞SGC7901和SKBR3有明显的促凋亡活性, 而对不表达HER2分子的ECV304细胞几乎没有影响。结论: ImmunoAIF△1
480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞。
【关键词】凋亡诱导因子; HER2阳性肿瘤细胞; 细胞凋亡
凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor, AIF)是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白, 全长为613个氨基酸, 成熟的AIF分子长为559个氨基酸, 由3部分构成: 1个FAD结合结构域(122262aa和400477aa), 1个NADH结合结构域(263399aa)和1个C末端结构域(481610aa)。AIF是一种双功能分子, N末端的FAD结合结构域及NADH结合结构域发挥着氧化还原酶的作用, 而分子C末端结构域具有促凋亡活性。AIF在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中[1], 当凋亡信号刺激时, 可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质, 然后转位到细胞核内, 直接介导细胞核发生凋亡[2-4]。之后, 研究人员在细胞中又发现了AIF的另一种亚型AIFsh(353613aa), 该亚型与AIF具有相似的促凋亡功能[5]。
鉴于AIF在细胞凋亡中具有的独特功能, 我们拟进一步探索其在基因治疗中应用的可能性。在成功克隆AIF△1120基因的基础上[6], 我室刘湘丽等[7]对AIF基因的结构进行了进一步截短, 构建了仅保留AIF分子C端(481613位aa)的AIF△1480基因, 并证明AIF△1480基因仍具有促凋亡活性, 说明AIF分子的氧化还原酶活性与促凋亡活性可以分离而不受影响。在本实验中, 我们将AIF△1480基因与具有转膜作用的九聚精氨酸(R9)基因及识别HER2抗原的单链抗体e23sFv基因重组, 构建了免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1480基因表达载体, 观察表达的免疫促凋亡分子对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。
1 材料和方法
材料 pcDNA3
e23sFvPEⅡAIF