文档介绍：三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠基因甲基化的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:周艳孙莉陈丹朱小春
【关键词】三氧化二砷 MRL/lpr 狼疮鼠基因甲基化
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是最常见、最严重的自身免疫性疾病之一,重症狼疮的治疗效果目前仍不理想,因此,国内外学者都在寻求新的有效药物和新的治疗方法。三氧化二砷在临床上应用于白血病治疗已有多年,并有明显疗效。近年来有将三氧化二砷(ATO)用于狼疮鼠的治疗,取得了一定的疗效[1~3]。本研究应用动物实验观察ATO对SLE模型自身免疫及基因甲基化的影响,旨在探讨ATO在红斑狼疮中的治疗价值及其作用机制。
1 材料和方法
实验动物的分组及处理 12周龄MRL/lpr小鼠24只(购自中国科学院上海实验动物中心,雌雄各半),随机分为ATO组和生理盐水(NS)组,各12只, mg·kg-1·d-1,NS组隔日腹腔注射生理盐水,疗程60d。另将20只12周龄C57雄鼠随机分为ATO组和NS组,各10只,处理同上。
试剂、材料三氧化二砷、鲑鱼精DNA及碱基标准品[腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)及胸腺嘧啶(T)]购自Sigma公司,HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物科技公司,基因组DNA抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所,96孔酶标板购自Costar公司。
检测项目及方法(1)抗dsDNA抗体水平测定[4]:ELISA方法测定用鲑鱼精DNA包被96孔酶标板,待测血清均作1:100稀释,结果在酶联免疫检测仪450nm处读出OD值。(2)DNA甲基化水平测定:DNA抽提及水解:使用试剂盒对各样品进行提取和纯化DNA,将约100μg基因组DNA和100μL氢氟酸混匀, 80℃水温育12h,然后于40℃烘箱至液体完全蒸发, mol/L,pH 100μL;色谱条件及甲基化水平测定:Agilent1100高效液相色谱仪,色谱柱:25cm×,5μm,Hypersil ODS C18反相色谱柱,柱温为20℃, mol/L、,,检测波长为280nm,进样量为20μl,先用流动相平衡色谱柱至基线平稳,开始将5种碱基标准品:(A、G、C、5mC、T)分别进样,工作站软件处理后得出峰形和每种标准品的持留时间,即可确定各种碱基流出顺序,再将样品逐个进样,得出峰形和数据后根据C和5mC的峰下面积按公式DNA甲基化水平(%) = 5mC/(5mC+C)×100 %,求得DNA甲基化水平。(3)血常规测定:应用SYSMEX KX21对各组小鼠外周血进行检测。
统计学方法采用SPSS ,资料用(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验。以P<。
2 结果
MRL/lpr小鼠治疗前后抗dsDNA抗体水平的变化在给药前ATO组和NS组的抗dsDNA抗体水平并无明显差异。治疗后ATO组小鼠的抗dsDNA抗体水平较NS组明显