文档介绍：NGF诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用
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作者:熊咏,田美玲,秦建兵,朱蕙霞,金国华
【摘要】目的:探讨大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞在NGF的诱导下分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。方法:应用无血清培养技术,分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞,然后在含或不含NGF的培养液中分化14d。用MAP-2免疫荧光和AChE组化技术检测神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。并对MAP-2阳性神经元的分化率、AChE阳性神经元数及其它们的细胞面积和周长进行图像处理;用STATA 。结果:隔区和皮层NGF组MAP-2阳性神经元分化率高于隔区和皮层对照组;其细胞面积除隔区NGF组与皮层NGF组之外,其它各组间差异均有统计学意义;而其周长各组之间差异均有统计学意义。AChE阳性神经元的数量及细胞面积和周长,隔区NGF组最佳,皮层NGF组次之,隔区对照组再次之,皮层对照组较差。三项指标各组间差异有统计学意义。结论:NGF可诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元分化;隔区神经干细胞较皮层神经干细胞更易于向AChE阳性神经元分化;这种区域特异性可在NGF诱导下发生改变。
【关键词】神经生长因子;神经干细胞;AChE阳性神经元;免疫组织化学法;大鼠
如何诱导神经干细胞向特定(目的)神经元分化是当今神经科学领域尚未解决的难题。神经干细胞的分化受细胞内在基因[1]、生长因子或细胞因子[2,3]及所处微环境[4]等因素的调控。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是发现最早、研究最为广泛和深入的一种神经营养因子,它不仅影响交感和感觉神经元的发育与存活,在胚胎期它还可以促进包括隔区在内的基底前脑胆碱能神经元的存活和发育。而NGF在神经干细胞向神经元或胆碱能神经元诱导分化方面是否也有作用,则鲜见报道。本研究分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞,然后用NGF诱导分化,通过MAP-2免疫荧光、AChE组织化学和图像处理等手段,检测神经干细胞分化为神经元和胆碱能神经元的情况。
1 材料和方法
鼠胚皮层和隔区神经干细胞的分离培养及鉴定
鼠胚皮层和隔区神经干细胞的分离和原代克隆取孕17d SD大鼠,腹腔注射复合麻醉剂chlorpent ,取出胚鼠放入无血清培养基中,分别取出皮层和隔区原基,剔除脑膜、脉络膜及血管等。然后按照田美玲等[5]报道的方法进行分离和原代克隆实验。
胚皮层和隔区神经干细胞的单克隆、传代和扩增将从原代克隆实验中分别获得的皮层和隔区神经干细胞球消化后,进行单克隆、传代和扩增。
胚皮层和隔区神经干细胞的检测为了验证所获取的胚皮层和隔区神经干细胞具有胚胎源性、增殖特性和多分化潜能,分别将单克隆后传至第2代的皮层和隔区的神经干细胞球进行Nestin免疫荧光检测、BrdU标记及免疫荧光检测和MAP-2、P的免疫荧光检测。
NGF诱导皮层和隔区神经干细胞的分化将单克隆后传至第3代的皮层和隔区的神经干细胞球接种至培养板中,每孔接种10个神经干细胞球左