RNA干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株HCT116凋亡的影响.doc

文档介绍：RNA干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株HCT116凋亡的影响
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【摘要】目的探讨存活素(survivin)干扰提高结肠癌细胞株HCT116对顺铂(CDDP)敏感性的有关机制。方法在HCT116细胞中,用lipofectamine 2000转染survivin的siRNA序列;荧光定量PCR检测survivin mRNA的表达;Western印迹检测survivin蛋白的表达;用流式细胞术法检测细胞凋亡率。结果 survivin的siRNA的转染显著降低了survivin蛋白的表达;瞬时转染survivin siRNA序列的HCT116细胞对低浓度( μg/ml)的CDDP作用下,凋亡率较阴性对照组明显升高。结论 survivin的干扰可以使survivin表达下调,诱导细胞凋亡,提高结肠癌细胞株HCT116对CDDP的敏感性。
【关键词】存活素;siRNA;细胞凋亡
存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族中的最小成员〔1〕,因其抑制凋亡的作用很强,在肿瘤的研究中有重要价值〔2〕。Survivin在结肠癌组织中过度表达,对结肠癌的发生与发展过程中起重要作用〔3,4〕。近年来研究发现survivin与抗肿瘤药物的耐药性密切相关〔5〕。因此本实验使用RNA干扰技术降低survivin在结肠癌细胞株HCT
116中的表达,检测survivin表达抑制细胞对低浓度化疗药物顺铂(CDDP)的敏感性,探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物CDDP作用不敏感的产生及可能机制。
1 材料与方法
试剂 DMEM、Trizol购自Invertrogen公司。胎牛血清购自四季青公司。AnnexinVPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒均购自凯基公司。青链霉素、胰酶购自吉诺公司。荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司,引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。Survivin抗体购于Santa Cruz公司。内参βactin、辣根过氧化物标记二抗购自北京中山公司。siRNA由上海吉玛公司合成。细胞购于生科院细胞所。CDDP购自山东齐鲁制药厂。
方法
细胞培养及转染 HCT116细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清,100 U /L 青霉素,100 U /L 链霉素) 中,37 ℃,5% CO2培养箱中培养。HCT116细胞接种于六孔培养板中,接种24 h后使用Lipofectamine2000进行转染。分别转染阴性对照siRNA与survivin特异性siRNA 5′GCAUCUCUACATT3′。
AnnexinVPI检测细胞凋亡收集1×105细胞PBS洗涤2次,以200 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl AnnexinvFITC混匀,加入5 μl PI混匀。室温避光15 min,流式细胞仪检测。
使用Trizol提取细胞总RNA 6孔培养板每孔中加入1 ml的Trizol裂解细胞,反复吹打3 ml的EP管内。静置5 min后每1 ml氯仿,