siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响.doc

文档介绍：siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张海英,刘亦恒,赵久红,张显芳,劳梅丽,易西南
【摘要】目的:观察沉默Robo2基因后对体外DRGs神经元突起生长的影响。方法:构建大鼠pSIH1H1copGFPRobo2 siRNA表达质粒,使用慢病毒(lentivirus)包装系统,在293T细胞中包装含Robo2 siRNA的慢病毒颗粒,然后转染DRGs神经元。实时荧光定量聚合酶链反应(RTFQPCR),Western blot检测Robo2 mRNA和蛋白的表达,显微镜下观察DRGs神经元突起生长情况。结果:RTFQPCR检测DRGs神经元中Robo2 mRNA的表达量,Robo组明显低于正常组,具有显著性差异()。Western blot检测DRGs神经元中Robo2蛋白的表达量,Robo组明显低于正常组,具有显著性差异()。Robo2 %,与正常组比较,Robo2 siRNAlentivirus转导细胞(Robo)组轴突生长明显受到抑制。结论:Robo2蛋白是DRGs神经元轴突生长的重要导向分子,可促进轴突的生长。
【关键词】 DRG;Robo2;基因沉默;大鼠

[ABSTRACT] Objective: To observe the silencing Robo2 on growth of DRGs neuronal neurite. Method: Rattus Robo2 siRNA was synthesized and clon
ed into pSIH1H1copGFP plasmid. pSIH1H1copGFPRobo2 siRNA lentivirus was generated in 293T cells by pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit and transducted into DRG neurons. Then,the Robo2 were tested by RTFQPCR and Western : The expression of Robo2 mRNA and Robo2 protein in Robo2 siRNAlentivirus group were lower than the normal group. The transduction rate of Robo2 siRNA was % by lentivirus vector. Robo2 siRNAlentivirus group can efficiently suppress neurite pared with normal : Robo2 can promote the growth of neurite of DRG.

[KEY WORDS] DRG; Robo2;Gene silencing;Rat

Roundabout (Robo)是一类与发育有关的保守跨膜受体家族,参与胚胎中枢神经轴突导向,促进树突分支、轴突生长,介导细胞迁移[1,2]。我们已报道成年大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)表达Robo及Slit,且周围神经损伤能改变DRG内Robo的表达,其中Robo1和Robo2表达增高[3]。Robo2是否参与了再生周围神经突起生长和导向?值得深入研究。本研究拟通过慢病毒载体,把针对Robo2基因的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)体外转染DRG 神经元,观察对DRG神经元Robo2表达及突起生长的改变。
1 材料与方法
细胞培养

大鼠DRG 神经元的分离培养:SD大鼠由湖南农业大学实验动物中心提供。无菌条件下取新生1周龄SD大鼠背根节,F12冲洗组织数次后,于解剖显微镜下剥离被膜,%%胶原酶内各消化30min,%胰酶继续消化15min,终止消化,在BSF2(含F12、1%%BSA)中吹打组织,900r/min离心5min,去上清,细胞重悬于含1mL BSF2的离心管内,在离心管底部添加2mL 15%BSA,900r/min离心10min,去上清,BSF2重悬细胞,置24孔板于CO2培养箱中培养。48h 后视细胞贴壁情况更换培养液。
试剂

pSIH1H1copGFP s