文档介绍：人参皂苷Rg1、Rb1对淀粉样前体蛋白分泌酶代谢途径的影响
作者:魏翠柏,贾建平,王芬,贾龙飞
【摘要】目的观察人参皂苷Rg1、Rb1对淀粉样前体蛋白代谢途径中α分泌酶活性和基因表达的影响。方法用转染突变型PS1(ML46L)和野生型PS1的CHO细胞,通过荧光酶标技术检测α分泌酶活性,Western blot免疫印迹、RT-PCR技术检测α分泌酶基因ADAM9、ADAM10的蛋白和RNA表达。结果转染突变型PS1 ML46L组α分泌酶活性较转染野生型PS1(WT组)低(P<),加用人参皂苷Rg1、Rb1后转染突变型PS1ML46L组α分泌酶活性较未加用组不同程度增高(P<),同时ADAM9、ADAM10的蛋白及RNA表达较未加用组有不同程度增多(P<)。结论人参皂苷Rg1、Rb1均可不同程度增加α分泌酶中ADAM9、ADAM10基因表达,提高α分泌酶活性,且人参皂苷Rg1调节作用优于人参皂苷Rb1。
【关键词】人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;淀粉样前体蛋白分泌酶;阿尔茨海默病
Key words:Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Rb1;secretase of amyloid precursor protein;Alzheimer’s Disease
β-淀粉样蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)在细胞外沉积构成的老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)主要病理学特征之一。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经α和β两种分泌酶裂解产生。有效地调整分泌酶活性和功能是防治AD的重要途径。
人参皂苷Rg1、Rb1是人参的主要有效成分。有报道,人参皂苷Rg1、Rb1具有抗氧化、抑制凋亡、抗兴奋性氨基酸毒性及有效抑制细胞外APP增多诱导的细胞凋亡等多种保护作用[1-2]。本研究拟研究人参皂苷Rg1、Rb1对APP代谢中分泌酶的影响,进一步探讨人参皂苷Rg1、Rb1对AD可能的防治作用。
1 实验材料
细胞来源及培养
突变型PS1ML46L和野生型APP751双转染细胞系(PS1ML46L/APP751)、野生型PS1和野生型APP751双转染中国仓鼠卵巢瘤细胞系(TW组)、中国仓鼠卵巢瘤细胞系(CHO)由美国哈佛大学医学院神经疾病研究中心构建,经中教授转赠。细胞均在37 ℃含有5%CO2的饱和湿度下培养,CHO细胞系培养用高糖DMEM,加入20%FBS,其中PS1ML46L/APP细胞培养基外加250 μg/mL G418、 μg/mL Puromycin。
试剂及药物
天然药物单体标准品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均购自中国药品生物制品检定所。ADAM9小鼠抗人单克隆抗体(批号ENM0139091)、ADAM10小鼠抗人单克隆抗体(批号FAL02)均购于美国RD公司。辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗小鼠二抗和羊抗兔二抗(批号73452)。RT-PCR试剂盒(批号18080-051)购于美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂盒(批号18341)购于美国Promega公司。α分泌酶活性检测试剂盒(批号FP001)为美国R&D生物公司出品。
2 实验方法
总RNA提取
按照RNAgents Total RNA Isolation System(Promega)试剂盒和superscriptTIM Ⅲ First-Strand Synthesis for RT-PCR试剂盒操作,提取总RNA并完成RT-PCR。Beta-actin扩增产物作为内参,所用引物由上海Sangon生物工程服务有限公司合成。引物的碱基序列及扩增的目的基因片段长度如下:①BACE1(上游:5’-AAG ATG TTC GGA ATG TGG GT-3’;下游:5’-CAG GGC TAC TAT GTG GAG ATG A-3’)。②ADAM9(上游:5’-AGT TCC TGG ACC CTG ATG C-3’;下游:5’-TTC TCC CGC C GCT AC-3’)。
③ADAM10(上游:5’-CAC TTG GCT TAT T A-3’;下游:5’-CTG CTT GGC CTA TGT CTT C-3’)。用Fluochemy5500凝胶图像分析仪采集图像,经Image Master TMTotal Lab Software图像分析软件计算条带光密度值。
α分泌酶活性荧光酶标测试
按照α分泌酶活性荧光酶标检测试剂盒中的操作说明。培养细胞经胰蛋白