文档介绍：用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液及胆固醇试剂的推广应用
用酶试剂测定血清总胆固醇(TC)推荐的方法,县有简易、快速、精密,特异性好,适应于自动或半自动生化分析仪及各类分光光度计等优点,在我国正在逐步取代强酸显色剂。全面推广使用TC酶法分析,胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(COD)需要有优质,价廉,充足的供应来源。上海医药工业研究院及河北省科学院微生物研究所研制的这两种酶,虽可达到常规生化检验的要求,但不能满足供应,所以我们引进了Boehinger公司CEH、COD,用甘油作保护剂制备了胆固醇三联酶液,设计以Trinder反应。)为基础的改进的TC测定法。液体胆固醇酶试剂减少了在制备过程中(如冻干球磨)酶活性的损失,保证了酶试剂质量,降低了成本。
材料和方法
(1)CEH、COD系西德Boehringer产品,CEH13300u/g(25℃),COD3580μ/g(25℃);辣根过氧化物酶(HRP,~2)上海华美生物工程公司产品,200u/ng(25℃)。
(2)KH2PO4、Na2HP4、12H2O及酚类均为喻尔滨市化工试剂厂产品;聚乙二醇辛基醚(乳化剂OP)为东湖塘化学试剂厂;4-氨基安替比林(4AAP)为上海试剂一广产品;甘油为吉林省军区化工厂产品;胆酸钠为Serra产品;胆固醇亚油酸酯为 Sigma产品,纯度99%。
(3)作对比研究用的酶试剂有美国BecRman、意大利Sdaro胆固醇试剂盒。
岛律LKB-260紫外分光光度计,IL公司M-10,MoA全自动生化分析仪及美国 ENCOR离心式自动生化分析仪;。
(1)试剂配方选择:
三联酶液:每升甘油PBS()酶稀释液中含CEH≤750u,COD≥750u, HRP≥5000u,在2-8℃环境中磁力搅拌2小时,分装安瓶(1ml/瓶),在-20℃环境中可保存2年,在2-8环境中可保存半年。
基础缓冲液:每升KH2PO4-Na2HP4缓冲液中(,2mmol/L)含胆酸钠3 mmol;4 ,%OP乳化剂及适当的防腐剂。
酚试剂:每升无离子水中含苯酚3 mmol()。
标准液:Bekmom水溶性胆固醇标准液()。
(2)TC测定:
将三联酶液与酚试剂,基质缓冲液按1::60比例混合,放置10分钟待用。测定 TC时血清及标准液与TC酶试剂按1:75比例混合,37℃,以光度计测吸光度(波长505nm)。
若用离心式自动生化分析仪,三联酶液,酶试剂及基质缓冲液2::60比例混合,血清与试剂比例不变(1:75)
(3)米氏常数(Km)的测定:
胆固醇亚油酸酯作底物,浓度为8×10-3-×10-3mmol/L,在COD足够的条件下与CEH作用时在波长240nm检测△+胆甾稀***的生成速度。以反应初速度与底物浓度按双倒数法(Line Wearer Burk法)作图求Km值。
实验结果
在酶偶联反应过程中,反应速度主戛取决于扁动酶(CEH)的特性,采用充足的COD和HRP活力与合适的显色反应